Протонная АТФ-синтетаза

Одна из совершенно новых задач, поставленных теорией протонного потенциала, — это выяснение вопроса о том, как устроены белки — генераторы тока.

Такого типа белки играют ключевую роль в превращениях энергии мембранными системами клетки. Большинство из них представляют собой давно описанные ферменты: переносчики электронов по дыхательной и фотосинтетической цепям ферментов и мембранные АТФ-синтетазы. Хемиосмотическая гипотеза лишь выявила их биологическую функцию, ответив на вопрос, что происходит с энергией, выделяющейся при реакциях, катализируемых этими ферментами.

Биохимики, изучавшие такие ферменты задолго до Митчела, и не подозревали, что имеют дело с одним из самых поразительных изобретений живой природы — молекулярными электростанциями. После утверждения новой теории они с досадой обнаружили, что оказались в положении мольеровского героя, который не знал, что всю жизнь говорит прозой.

Однако сам факт, что ферменты дыхания, фотосинтеза, а также определенные АТФ-синтетазы играют роль генераторов тока, еще ничего не может сказать о механизме их действия. А ведь тут есть чему удивиться и над чем задуматься. По существу, перед нами действительно миниатюрные электростанции молекулярных размеров. Толщина мембраны, куда встроен белок-генератор, около 70 ангстрем, или 7 миллионных долей миллиметра. В мембрану вмонтирована молекула белка, причем сделано это таким образом, что противоположные концы белковой молекулы выходят на поверхность мембраны с двух разных сторон. Например, протонная АТФ-синтетаза состоит из двух частей: грибовидного выроста, который смотрит в воду внутрь митохондрий, и цилиндра, пронизывающего толщу мембраны. Основание цилиндра прикреплено к грибовидному выросту, а его верхняя часть вынесена на другую сторону мембраны, то есть в воду, находящуюся снаружи митохондрий.

Молекулярные электростанции

Грибовидный вырост протонной АТФ-синтетазы можно увидеть под электронным микроскопом, если обработать обрывки митохондриальных мембран веществом-контрастером, поглощающим электроны гораздо сильнее, чем это делают мембранный белок или липид. В этих условиях мембрана выглядит под электронным пучком светлой, а окружающее ее пространство — черным.

Чтобы получить изображение АТФ-синтетазы, нашей сотруднице Л. Бакеевой пришлось использовать практически предельное увеличение, которое позволяет дать электронный микроскоп (около одного миллиона раз). Полученный негатив был затем увеличен еще втрое при изготовлении позитива с электронно-микроскопического снимка. В итоге же изображение оказалось в 3 миллиона (!) раз крупнее действительной величины фотографируемого объекта. Уже одно это число красноречиво свидетельствует, сколь малые размеры выбрала живая природа, создавая биологический генератор тока. А ведь протонная АТФ-синтетаза отнюдь не самый маленький белок-генератор. Бактериородопсин в 20 раз мельче.

Грибовидные выросты на мембране митохондрий были впервые описаны в 1962 году американским микроскопистом X. Фенандес-Мораном. Д. Грин немедленно отреагировал на это открытие гипотезой о том, что в выростах локализуются дыхательные ферменты. Оснований для подобного предположения у него не было, и сейчас уже невозможно понять, что толкнуло автора на поспешную публикацию.

Э. Ракер и Б. Чане взялись проверить гипотезу Грина. Оказалось, что обработка фрагментов митохондрий мочевиной приводит к исчезновению «грибов». Чане измерил (на особом спектрофотометре собственного изобретения) поглощение света мембранами, обработанными мочевиной, и обнаружил в них полный набор дыхательных ферментов, благо все они окрашенные белки с характерными спектральными максимумами. Значит, гипотеза Грина не проходит.

Тогда Ракер решил посмотреть, как обстоит дело с ферментами фосфорилирования. Его логика была примерно такова: раз в «грибах» нет ферментов дыхания, то скорее всего должны быть ферменты фосфорилирования, поскольку эти две группы ферментов — самые массовые в митохондриях. То, что речь идет о каком-то массовом ферменте, было ясно уже из простого просмотра микрофотографий. «Грибов» на мембране такое количество, что между двумя соседними невозможно уместить третий.

В первых же опытах выяснилось, что мембраны, лишенные «грибов», не способны ни к фосфорилированию АДФ, ни к дефосфорилированию АТФ. Стало быть, действительно «грибы» — какая-то деталь фосфорилирующего механизма митохондрий. Но что же происходит с «грибами» под воздействием мочевины?

Известно, что мочевина нарушает многочисленные временные связи, возникающие внутри белков и между белками. Если «гриб» держится за мембрану за счет таких связей, есть шанс, что мочевина не разрушает «грибы», а просто отделяет их от мембраны. Тщательный просмотр микрофотографий убедил Ракера, что в растворе, где находились фрагменты митохондрий, после добавления мочевины появляются сферические частицы диаметром около 85 ангстрем. Центрифугирование всей этой смеси в течение часа при ускорении, в 100 тысяч раз превышающем силу земного тяготения, привело к ее разделению на осадок (в нем были фрагменты мембран) и надосадочную жидкость, содержавшую сферические частицы. Их удалось осадить добавлением соли.

Так в руках Ракера оказалась чистая фракция «грибов». Как показали последующие опыты, «грибы» с большой скоростью расщепляли АТФ до АДФ и фосфата. Более того, добавив «грибы» к обработанным мочевиной мембранам, ученый обнаружил, что на мембране вновь появились грибовидные выросты. При этом возвратилась способность к синтезу АТФ, сопряженному с дыханием.

Определение массы «гриба» показало, что она порядка 385 килодальтон, или в 385 тысяч раз больше массы атома водорода. «Гриб» оказался составленным из нескольких индивидуальных белков с массами от 10 до 55 килодальтон. Еще несколько белков с общей массой порядка 100 килодальтон было обнаружено в мембранной части протонной АТФ-синтетазы. Эти последние нужны для прикрепления «гриба» к мембране и переноса протонов через мембрану. Таким образом, суммарная масса одной молекулы митохондриальной АТФ-синтетазы оказалась чуть меньше 500 килодальтон.

Как же работает этот довольно сложный и внушительный по молекулярным масштабам агрегат?

Рассмотрим сначала реакцию, когда расщепление АТФ ведет к генерации протонного потенциала. Простой опыт показывает, что АТФ взаимодействует первоначально с «грибом», а не с мембранным сектором белкового генератора. Если к митохондриям добавить АТФ, то он не расщепится, пока не пройдет через мембрану и не окажется внутри митохондрии, куда обращены грибовидные выросты.

Ясно также, что гидролиз АТФ происходит в «грибах», поскольку белки мембранного сектора с АТФ не взаимодействуют. Зато они способны к переносу протонов. Эта их активность может быть продемонстрирована, так сказать, в чистом виде на мембранах, лишенных «грибов». Такие мембраны свободно пропускают ионы Н+, причем добавление «грибов» блокирует эту протонную проводимость. Можно нарушить проводимость другим путем — добавлением олигомицина. Кроме того, этот антибиотик прекращает как синтез, так и гидролиз АТФ в исходных мембранах, но не влияет на гидролиз АТФ «грибами», отделенными от мембраны.

По-видимому, мембранные белки АТФ-синтетазы образуют проводящий протоны канал, который связывает «гриб» с противоположной (наружной) стороной мембраны митохондрии. «Гриб», как пробка в графине, закрывает выход из канала на внутренней стороне мембраны. После удаления «гриба» канал становится сквозным, связывая между собой вне- и внутримитохондриальные пространства. Олигомицин нарушает работу канала.

Если «гриб» отделен от мембраны и свободно плавает в воде, то гидролиз АТФ не может привести к созданию протонного потенциала просто из-за отсутствия мембраны, разделяющей пространство на два изолированных отсека.

Если «гриб» прикреплен к мембране и состыкован с каналом, то гидролиз АТФ сопровождается переносом протонов из митохондрии наружу.

Проще всего этот процесс можно представить себе следующим образом. Внутри митохондрий АТФ связывается с «грибом», переносится куда-то в глубь мембраны и там расщепляется на анионы АДФ и фосфата (АДРО- и -ОР):

АДРОР + Н2O ? АДРО- + -ОР + 2Н+, где АТФ обозначен как АДРОР.

Затем ионы Н+ выделяются в канал и выходят наружу, а АДРО- и -ОР переносятся внутрь митохондрии и там связывают протоны:

АДРО- + -ОР + 2Н+внутр. ? АДРОН + НОР.

Процесс в целом описывается уравнением: АДРОР + 2Н2O + 2Н+внутр. ? =АДРОН + НОР + 2Н+наружн.

Реакция гидролиза АТФ сопровождается выделением энергии. Поэтому сопряженный с ней перенос ионов Н+ изнутри митохондрий наружу получает возможность идти в энергетически невыгодном направлении, создавая внутри нехватку ионов Н+ и положительных зарядов. Эта нехватка должна возрастать по мере того, как все новые молекулы АТФ гидролизуются митохондрией.

Значит, чем дольше работает АТФазный генератор, тем труднее ему переносить ионы Н+ через мембрану. В конце концов генератор выключится вовсе. Это произойдет в момент, когда выигрыш в энергии от гидролиза уравняется с проигрышем в энергии, сопутствующим переносу ионов Н+ против электрического поля из отсека, где ионы Н+ в дефиците, в отсек, где они в избытке.

Если теперь включить какой-нибудь другой протонный генератор, откачивающий ионы Н+ из митохондрий, например, за счет энергии дыхания, то митохондриям окажется выгоднее впускать внутрь ионы Н+, синтезируя АТФ, чем выталкивать ионы, гидролизуя АТФ. Другими словами, итоговая реакция, приведенная выше, изменит направление и потечет справа налево. Гидролиз АТФ сменится его синтезом, то есть возникнет процесс дыхательного фосфорилирования.

Таковы общие черты устройства протонной АТФ-синтетазы. Однако существенные детали этого механизма все еще остаются неясными, затрудняя выбор между несколькими возможными схемами, призванными описать принцип его работы.

Один из ключевых вопросов — это как, каким способом АТФ, АДФ и фосфат переносятся из водной фазы митохондрии в гидрофобную фазу митохондриальной мембраны, чтобы попасть в сферу действия электрического поля?

АТФ, АДФ и фосфат — это весьма гидрофильные многозарядные анионы. Их сродство к воде очень велико, а к липиду — ничтожно. Чтобы помочь этим веществам перейти из воды внутрь мембраны, необходимо какое-то специальное приспособление. Что бы это могло быть?

Помня, каким скользким может быть путь аналогий, мы тем не менее рискнем обратиться к другой белковой системе, также присутствующей в митохондриальной мембране и имеющей дело с АТФ и АДФ. Я имею в виду так называемый АТФ/АДФ-антипортер.

М. Клингенбергом был получен в чистом виде и подробно исследован мембранный белок массой 30 кило-дальтон, способный обменивать содержащийся в митохондриях АТФ на внемитохондриальный АДФ (этот процесс обозначается термином «антипорт»). Выяснилось, что у антипортера есть два места связывания АТФ и АДФ. Белок закреплен в мембране таким образом, что эти два места обращены в воду по разные стороны мембраны. Если к белку на внутренней поверхности мембраны присоединяется АТФ, а на внешней — АДФ, то молекула белка поворачивается на 180 градусов или совершает какое-то более сложное движение, в результате которого участок белка с АТФ появляется снаружи митохондрии, а участок с АДФ - внутри.

Поворот в обратном направлении затрудняется электрическим полем, генерируемым на мембране митохондрий за счет дыхания. Дело в том, что АТФ несет на себе четыре отрицательных заряда, а АДФ — только три. Обмен наружного АТФ4- на внутренний АДФ3- означал бы перенос внутрь митохондрии отрицательного заряда против электрического поля. В то же время обратный процесс должен идти по полю, которое может быть движущей силой такого обмена.

Мой коллега И. Козлов выдвинул предположение, что та часть АТФ-синтетазы, которая имеет дело с АТФ, АДФ и фосфатом, устроена по принципу АТФ/АДФ-антипортера.

Предполагается, что в АТФ-синтетазе есть два места связывания субстратов реакции. Одно из них обращено в водное пространство внутри митохондрии, другое погружено в мембрану.

Согласно гипотезе при синтезе АТФ происходит антипорт АТФ4-/(АДФ3- + РО43-) между двумя местами связывания. Если рассчитать суммарный баланс переносимых при таком антипорте заряженных групп, то окажется, что из воды внутрь мембраны перенесены два отрицательных заряда. Электрическое поле, генерируемое на мембране дыхательными ферментами (минус внутри митохондрий), способствует антипорту АТФ4-/(АДФ3- + РО43-): поле должно удалять АТФ из внутримембранного места связывания, заменяя АТФ на АДФ и фосфат.

Приняв, что синтез АТФ из АДФ и фосфата происходит именно во внутримембранном месте связывания, мы можем объяснить, каким образом поле, создаваемое дыханием, смещает равновесие системы АДФ + фосфат ? АТФ в сторону синтеза АТФ. Поле как бы концентрирует АДФ и фосфат в каталитическом центре АТФ-синтетазы и откачивает оттуда образующийся продукт (АТФ).

Другой «приводной ремень» этого механизма — транспорт протонов.

Предполагается, что 2Н+, фигурирующие в левой части уравнения, поступают в каталитический центр АТФ-синтетазы из водной среды, окружающей митохондрию. Транспорт протонов происходит по полю (в сторону заряженного отрицательного внутреннего объема митохондрии). Тем самым одна и та же сила: разность электрических потенциалов - способствует тому, что к каталитическому центру АТФ-синтетазы с одной стороны мембраны устремляются АДФ и фосфат, а с другой стороны — ионы Н+.

Эта схема непротиворечиво объясняет всю совокупность сведений об АТФ-синтетазе, однако было бы ошибкой считать ее доказанной. Пока она лишь рабочая гипотеза, иллюстрирующая, как мог бы работать один из важнейших мембранных преобразователей энергии.