«Замороженная жизнь» и рождение животных путем трансплантации (пересадки) зигот

«Замороженная жизнь» и рождение животных путем трансплантации (пересадки) зигот

Мы рассмотрели проблемы, связанные с научными достижениями в области продолжительного сохранения мужских половых клеток — сперматозоидов, глубокое замораживание которых приводит их в состояние анабиоза.

Но достигнутые успехи не могли полностью удовлетворить ученых. Стал реальным способ замораживания спермы и ее длительного хранения. Почему же не добиться таких же результатов с уже оплодотворенными женскими половыми клетками (яйцеклетками)? Эта идея была осуществлена после 60-х годов, когда получил распространение метод, названный пересадкой зигот.

Чем же обусловливается повышенный интерес к этому столь перспективному, по мнению ученых, методу? Он вызван как большими теоретическими и прикладными возможностями метода, так и его биологической и экономической эффективностью. Применяя этот метод, можно получить возможность более полноценно использовать огромный биологический потенциал плодовитости, присущий определенным породистым самкам животных. Известно, например, что в яичниках коров имеется свыше 80 — 100 тыс. женских половых клеток. Из них за период эксплуатации одной коровы обычно выделяются и оплодотворяются лишь 5 или 6 яйцеклеток и соответственно рождаются 5 или 6 телят. Остальные яйцеклетки не могут реализовать свои возможности. До сих пор для создания стада из потомков коровы с генетически выявленной продуктивностью были необходимы десятки лет. Если корове-донору ввести гормоны, стимулирующие функцию яичника, то можно вызвать суперовуляцию, при которой одновременно выделяется 12–15 и больше яйцеклеток вместо одной, как это происходит при нормальной циклической функции яичников. Эти яйцеклетки попадут в яйцевод, где их при искусственном осеменении оплодотворят консервированными сперматозоидами, взятыми от племенных производителей, потомство которых обладает высокопродуктивными качествами. Зиготы извлекают на 6-й или 7-й день, оценивают под микроскопом их жизнеспособность, а затем, глубоко заморозив (до состояния анабиоза), сохраняют в специальной среде. В нужный момент их размораживают и пересаживают в половой аппарат низкопродуктивных коров — «приемных матерей». Пересаженные зиготы (от высокопродуктивных животных) вынашивают до рождения низкопродуктивные животные, причем они не в состоянии повлиять на наследственные признаки этих зигот. Биологический эффект такого метода состоит в том, что от коровы с высокопродуктивными качествами (дающей, например, 10 тыс. л молока в год), можно будет получить за 2–3 года 50–60 телят. Все они будут обладать генетически обусловленной высокой продуктивностью элитной матери — донора. В этом и заключается большой экономический эффект. Подкрепляется он и еще одним обстоятельством: вместо того чтобы ввозить высокопродуктивных коров из-за границы, для чего необходим специальный транспорт, затрата больших средств, причем животные подвергаются естественному риску заболеваний, создается возможность получать такие же ценные экземпляры посредством международного обмена замороженными консервированными зиготами.

Метод трансплантации открывает возможность увеличения рождаемости у коров телят-близнецов, что увеличивает производство мяса. Этого можно добиться путем пересадки двух зигот «приемной матери».

Идея пересадки зародышей не нова. Еще в 1890 г. в Кембриджском университете англичанин Уолтер Хип сумел получить таким способом двух кроликов ангорской породы от крольчих породы «Бельгийский великан». Но более полувека никто не обращал внимания на эту интересную новость в биологии размножения. Только в 1950 г. коллектив под руководством профессора Роусона из Кембриджа начал проводить опыты по пересадке зародышей у крупного рогатого скота[19]. В период 1964–1969 гг. уже появились первые сообщения об успешных опытах с коровами: Роусона и его сотрудников, а позже Беттериджа и Митчела (1974 г.); Хана и его сотрудников (1974); Микельса (1974 г.); Грэхема (1974 г.); Гордона (1975 г.) и других. Для этого периода характерно то, что до 1976 г. зиготы извлекали хирургическим путем. Позже все большее распространение получило извлечение зигот с помощью зонда. Это метод дает лучшие результаты, и его можно применять в условиях молочной фермы. Извлеченные зиготы подвергают тщательному исследованию, и в случае одобрения их пересаживают коровам или переводят в состояние анабиоза, замораживают для сохранения на более продолжительный срок и использования в будущем.

Криоконсервация имеет два серьезных преимущества: во-первых, пересадку можно осуществлять в нужный момент и, во-вторых, законсервированные зиготы можно перевозить на большие расстояния (даже за границу).

Преимущество нехирургических методов извлечения и пересадки зигот у крупного рогатого скота состоит в следующем: возможности повторного использования одной и той же коровы-донора; пересадку можно осуществлять в условиях молочной фермы, когда корова находится в стоячем положении; нет опасности, связанной с вскрытием перитониальной полости.

Однако у овец, коз и свиней пока продолжают применять хирургические пересадки, в то время как у лошадей нехирургические методы дали до 75 % выживаемости пересаженных зародышей[20].

В последнее время разработаны методы кратковременного сохранения зигот коров в яйцеводах крольчих, которые в данном случае используются как промежуточные биологические «инкубаторы». Этих крольчих можно без труда перевозить на большие расстояния, и в течение нескольких дней сохранять зиготы, которые затем пересаживают подготовленным для этой цели телкам и коровам. Этот метод однажды поспособствовал одной курьезной операции: находчивые контрабандисты, чтобы переправить через границу запрещенную к вывозу ценную породу крупного рогатого скота, с помощью специалистов пересадили зиготы в яйцеводы крольчих, которых «законным путем» вывезли в другую страну.

Возможность пересаживать зиготы одного вида животного другому виду натолкнула ученых на мысль попытаться осуществить пересадку зигот редких видов диких животных, которые в условиях неволи в зоопарках не приносят потомства. Так, например, недавно в США благодаря сотрудничеству между несколькими зоопарками и университетским медицинским центром в штате Цинциннати был извлечен зародыш из утробы тигрицы и пересажен львице, которая и родила тигренка[21]. Подготавливаются опыты и с другими редкими видами диких животных. Специалисты считают, что таким образом можно будет сохранить некоторые виды животных, которых остается все меньше и меньше. Так, например, полным ходом идет подготовка экспериментов по пересадке коровам зародышей некоторых диких африканских и индийских видов жвачных животных, которым грозит полное исчезновение.

В течение последнего десятилетия многое сделано для того, чтобы добиться длительного сохранения зигот посредством их замораживания при сверхнизких температурах (путем перевода их в состояние анабиоза) или, иначе говоря, обеспечить своего рода «замороженную жизнь». Однако в отличие от спермы, в которой при замораживании сохраняется свыше 10 млн. сперматозоидов в каждой дозе, зародыш представляет собой значительно более сложную структуру. Его клетки содержат 90 % воды, в связи с чем существует опасность образования кристалликов льда. Вот почему ученые сконцентрировали свои усилия на использовании криопротекторов, которые после размораживания зародышей можно удалить. Перед использованием для трансплантации замороженные зародыши снова подвергаются тщательной проверке.

В начале 70-х годов специалистами из Национальной лаборатории в Оук Ридже (США) удалось впервые заморозить зародыши лабораторных мышей при температуре — 196 °C, не повредив их. Эти зародыши после размораживания были пересажены в матку самок мышей, продолжили развитие, и родились вполне нормальные мышата. Но для того чтобы добиться этого успеха, пришлось заморозить при различных низких температурах свыше 2500 зародышей на различных стадиях их развития (от одной клетки до многоклеточных). Например, 1 тыс. зародышей заморозили при температуре -196 °C. После размораживания большинство из них оказались вполне жизнеспособными. Когда их пересадили в организмы самок мышей, они нормально развивались до взрослых животных, способных продолжать род.

Успех опыта объясняется тем, что замораживание и размораживание производились исключительно медленно и с применением специальных веществ, предотвращающих образование кристалликов льда. Задача заключалась в том, чтобы вода при замораживании не переходила в кристаллическое состояние, а постепенно диффундировала из зародышей. Опыты давали положительные результаты, если температуру понижали со скоростью от 0,3 до 2 °C в минуту. Когда же процесс замораживания ускоряли до 7 °C и более в минуту, все зародыши погибали.

В 1973 г. ученым из Кембриджа (Англия) сопутствовал успех в новом опыте: родился теленок из замороженного зародыша, ранее законсервированного при температуре — 196 °C. Корова, у которой извлекли этот зародыш, не стала матерью животного. После оплодотворения путем искусственного осеменения зиготы извлекли из организма коровы-матери и пересадили другой корове, которая вынашивала теленка в течение 9 месяцев.

Благодаря этому методу можно сохранять зародыши некоторых ценных пород буквально десятилетиями, т. е. даже и после того, как сами производители умрут. Взятые у них зародыши можно заморозить и сохранить.

В 1979 г. советскими учеными была успешно осуществлена пересадка замороженного, а затем размороженного зародыша. Советские ученые испробовали пересадку зародышей различного «возраста», замороженных и незамороженных, на разных стадиях полового цикла коровы — «приемной матери».

Как уже было сказано, метод замораживания дает возможность транспортировать зародыши даже через границы. Так, например, летом 1979 г. в Научно-исследовательском центре животноводства около города Ростока (ГДР) родился «экспериментальный» теленок. Необычным в этом случае было то, что он развился из яйцеклетки, оплодотворенной в Зоотехническом институте польского города Белица. Вскоре после оплодотворения зиготу заморозили при температуре -196 °C, перевезли в ГДР и сохраняли в жидком азоте более 3 месяцев. Затем зиготу извлекли из азота, постепенно разморозили и пересадили в матку телки местной породы. Через определенное время родился здоровый теленок весом 67 кг.

Методом глубокого замораживания зародышей стало возможно консервировать чистые линии лабораторных мышей, сохраняя замороженные зародыши, вместо того чтобы непрерывно содержать и разводить животных для сохранения нужной линии. Этот метод предлагает и способ сохранения редко используемых мутантов и вариантов, что более выгодно с точки зрения экономической, чем поддерживать их живыми. Безусловно, этот метод представляется надежным средством против потерь вследствие какого-нибудь несчастного случая или опасного заболевания.

Хотя большую часть исследований до сих пор проводили на лабораторных мышах, в последнее время получены результаты и при замораживании зародышей крыс и кроликов. Уже ряд лабораторий в Европе, Америке, Японии и Австралии создал «банки замороженных зародышей», в которых надежно сохраняются ценные линии лабораторных животных. Обсуждается даже возможность с помощью этих «банков зародышей» из различных стран создать «международную коллекцию замороженных культур лабораторных животных». Подобные замороженные зародыши при необходимости можно быстро транспортировать через границы[22].

Французские ученые из Центра научных исследований «Жуан-Жозас», стремясь установить, не оказывает ли замораживание отрицательного влияния на зародыши, занялись изучением морфологических изменений замороженных зародышей крупного рогатого скота. С помощью сканирующего электронного микроскопа они исследовали структуру изменения на поверхности зародышей и установили, что после замораживания и размораживания заметных нарушений не наблюдалось.

Почти целое десятилетие ученые изучают проблемы долговременного консервирования зародышей путем замораживания (в состоянии анабиоза). Из размороженных зародышей уже получено несколько тысяч животных различных видов. Многие специалисты склонны считать, что подобная процедура со временем станет такой же обычной, каким ныне стало искусственное осеменение.

В последнее время стало возможным распознавать пол зародыша путем анализа хромосом клеток наружного слоя зародышевого пузыря, однако при этом снижается вероятность того, что зародыш уцелеет. Пол можно определить, прибегнув к некоторым иммунным реакциям, связанным с Y-хромосомой, или выявив половой хроматин в ядрах клетки из околоплодной жидкости, которую извлекают с помощью пункции через влагалище или перитонеум в количестве около 10 мл в течение первой половины беременности. При наличии полового хроматина, находящегося на внутренней поверхности ядерной мембраны, можно с полной уверенностью установить, что плод — женского пола. В некоторых странах (Канаде и др.) уже получены телята желаемого пола. В комбинации с техникой замораживания этот метод предоставляет возможность выбирать между мужским и женским приплодом.

Новая техника раскрывает огромные возможности перед селекционерами, занимающимися созданием новых пород. Наследственность любого высокопродуктивного животного может быть сохранена в течение длительного срока путем замораживания зародышей, так что даже преждевременная смерть производителя не приведет к неотвратимым последствиям и полной потере породы.

Для увеличения приплода сельскохозяйственных животных во многих лабораториях проводится ряд интересных и перспективных опытов. Так, например, оказалось, что если между 6-м и 7-м днем развития зародышей произвести с ними некоторые требующие особенной осторожности и точности манипуляции, в результате рождаются ягнята-близнецы и телята-близнецы.

Ныне усилия ученых направлены на получение зародышей путем оплодотворения яйцеклетки in vitro (вне организма) — так называемых животных из пробирок[23]. Таким способом можно получить много зародышей от животных с исключительно ценными продуктивными качествами. В этом отношении уже достигнуты заметные успехи. Так, в 1981 г. сообщалось, что на ветеринарном факультете Пенсильванского университета родился первый в мире теленок из пробирки. Точнее, оплодотворение было произведено не в пробирке, а в небольшом стеклянном сосуде для выращивания культур. Руководитель группы, осуществивший этот эксперимент, сообщил, что беременность продолжалась 280 дней, теленок родился здоровым и вполне нормальным во всех отношениях. Неоплодотворенную зрелую яйцеклетку взяли у породистой коровы и после оплодотворения размороженными сперматозоидами поместили ее в специальные инкубационные условия. Позже зародыш пересадили в матку другой коровы, которая нормально его выносила. Это достижение раскрывает перед животноводством богатые перспективы. Специалисты надеются, что эти исследования помогут решить и некоторые проблемы бесплодия у человека.

В планах на будущее ученые ставят перед собой задачу после извлечения зиготы из организма и помещения ее в стеклянный сосуд, применив современные методы электронной микроскопии, биохимии и иммунологии, изучить сложные биологические процессы, протекающие в течение одного из самых важных периодов процесса размножения — начального эмбриогенеза. Используя способ так называемой зиготной инженерии, можно будет осуществить межклеточную гибридизацию, а также выяснить некоторые процессы в иммунных отношениях между матерью и плодом. Предполагается, что можно будет размножать зародыши от идеальных родительских пар путем пересадки ядер клеток зародыша на начальных стадиях развития в только что оплодотворенные яйцеклетки. У лягушек этого добились еще 30 лет тому назад, но до сих пор из всех млекопитающих, над которыми производился этот сложный эксперимент, успех отмечен только у лабораторных мышей (и то лишь в самое последнее время)[24].

Исследования в области трансплантации зигот в Болгарии и в других социалистических странах согласуются в рамках СЭВа. Осенью 1979 г. в Варне состоялось совещание экспертов из социалистических стран по вопросам трансплантации зигот у животных. Болгарскую делегацию возглавлял видный ученый в области биологии размножения академик Кирилл Братанов. На совещании был учрежден международный научно-исследовательский коллектив по проблемам пересадки зигот, который должен объединять и согласовывать работу специалистов из социалистических стран. На Институт биологии и иммунологии размножения и развития организмов при Болгарской Академии наук возложена разработка иммунологических проблем, связанных с пересадкой зигот. Болгарскому коллективу ученых, возглавляемому академиком К. Братановым, поручено заниматься разработкой технологии — этого особенно перспективного метода в овцеводстве.

С 1979 г. сотрудники Института биологии и иммунологии размножения и развития организмов при Болгарской академии наук под руководством доктора К. Блахова при содействии Научно-производственного объединения по разведению крупного рогатого скота и овцеводству при Национальном агропромышленном союзе (НАПС) провели ряд опытов с трансплантацией зигот у овец. Были получены первые ягнята, из них некоторые — результат опыта, проведенного совместно с Институтом зоотехнии в Кракове. Оплодотворенные яйцеклетки, полученные в Польше, были доставлены самолетом в Болгарию, где их хранили в течение 320 дней при температуре — 196 °C (жидкий азот). Затем размороженные зиготы пересадили специально подготовленным овцам, которые их выносили и родили ягнят. Болгарские специалисты провели удачные опыты по пересадке зигот у овец и в Институте горного животноводства и земледелия в городе Троян. Там родились жизнеспособные ягнята с высоким весом (6300 г). До середины 1983 г. в результате пересадки зигот в Болгарии родилось 20 ягнят. В 1981–1982 гг. на молочной ферме села Рыжево Конаре Пловдивского округа получено несколько телят от пересаженных свежих зародышей. На этой же ферме в феврале 1983 г. родились 4 теленка от замороженных зародышей, полученных из Чехословакии. В будущем при Сельскохозяйственной академии предусматривается организация центра по пересадке зигот.

Новая техника предоставляет специалистам животноводства возможность улучшать качества стада значительно быстрее, чем при искусственном осеменении. Можно будет подбирать не только отца, но и мать, причем молодняк производится «приемными матерями». Если родятся телята женского пола, они вольются в стадо. Если потомство окажется мужского пола, некоторых из них оставят для нужд племенного разведения. Новый метод поможет приступить и к другим начинаниям, например, к превращению молочного стада скота в стадо, дающее мясо. Представляется возможность продолжить род животных с особенно ценными качествами, жизнь которых подходит к концу. Для вышеуказанных целей достаточно сохранить их последних зародышей.

Если 10 лет назад проблема пересадки зигот ограничивалась сферой лабораторных исследований, то сейчас накопленный богатый опыт внедрен в практику животноводства и способствует интенсификации работ по разведению и улучшению пород скота и выяснению важных теоретических проблем в области биологии размножения.

Метод трансплантации зигот быстро прогрессирует. Это подтверждается следующими фактами: только в 1980 г. в США этим методом было «произведено» 23 тыс. телят, в Канаде — 7 тыс., в Швеции — тоже несколько тысяч.

С генетической точки зрения этот метод дополняет искусственное осеменение при улучшении стад сельскохозяйственных животных. С экономической точки зрения замороженные зародыши оказались исключительно удобными для международного обмена животными. Замороженные зародыши значительно лучше, чем живые представители соответствующей высокопродуктивной породы, переносят продолжительные перевозки.