Центр размножения: соматическое гипермутирование перестроенных V(D)J-генов

Центр размножения: соматическое гипермутирование перестроенных V(D)J-генов

Все имеющиеся данные говорят о том, что в В-лимфоцитах мутируют только перестроенные V(D)J-гены, кодирующие белок антитела. Другими словами, вариабельные гены, остающиеся в конфигурации зародышевой линии, т. е. неперестроенными, не накапливают соматических мутаций. Следовательно, первым этапом контроля, позволяющим появляться только «благоприятным мутациям», является перестройка ДНК, в результате которой образуется V(D)J-мишень, на которую действует мутатор. Следующий этап контроля — это сама мутационная машина, которая должна связываться с уникальной структурой, ассоциированной с перестроенной V(D)J-последовательностью и ограничивающей мутирование только этим участком ДНК.

Надо отметить еще один важный момент. Процесс соматического гипермутирования у мышей и человека вызван стимуляцией антигеном. У других видов (например, овцы) соматический мутагенез в специализированных лимфоидных тканях, связанных с кишечником, включается другими сигналами (они пока неизвестны). Таким образом, изменчивость V(D)J-генов лимфоцитов вызвана влиянием окружающей среды или адаптивным сигналом. Это означает, что в ходе развития иммунной системы организма генетическая изменчивость может быть вызвана средой. Это противоречит неодарвинистской догме о том, что вся изменчивость генов зародышевой линии предсуществует до того, как начинает действовать отбор. Решающий эксперимент, доказывающий этот важный момент, был проведен Урсулой Сторб (Storb) с коллегами в середине 1980-х гг. Авторы ввели ограниченное число копий известного перестроенного гена легкой цепи (VJ) в ДНК зародышевой линии инбредных мышей (такие животные называются трансгенными). Им удалось показать, что у неиммунизированных трансгенных мышей VJ-трансген не мутировал: последовательность нуклеотидов этого участка ДНК, выделенного из В-лимфоцитов селезенки трансгенных мышей, не изменилась. Однако при иммунизации антигеном, который связывает антитела, кодируемые этой VJ-последовательностью, VJ-трансген накапливал многочисленные соматические мутации.

Где происходят соматические мутации? Могут ли они возникать в подвижных В-клетках в крови и лимфе, или они происходят в каких-то особых местах? В середине 1980-х гг. Дэвид Грей (Gray) и Йан Макленнан (MacLennan), работающие в Университете Бирмингема, предположили, что соматические мутации происходят в специализированных постантигенных образованиях, называемых центрами размножения. Такие участки интенсивного деления (пролиферации), появляющиеся после стимуляции антигеном в лимфатических узлах и селезенке, давно известны. Также было известно, что 80% В-клеток в центре размножения (или даже больше), по-видимому, там же и погибают. В 1960-х гг. Гас Носсал (Nossal) и Гордон Эйда, работающие в Медицинском центре Уолтера и Элайзы Холл, используя радиоактивно меченные белковые антигены установили, что недеградированные формы антигена, связанные с антителами, располагаются на поверхностной мембране клеток в центре размножения (и могут оставаться там в течение многих месяцев). Комплексы антиген—антитело располагаются на поверхности крупных специализированных клеток, выросты клеточной мембраны (дендритные выросты) которых распространяются по всему центру размножения. Эти клетки называются фолликулярными дендритными клетками (ФДК).

Фолликулярные дендритные клетки в центре размножения взаимодействуют с популяцией В-клеток (рис. 5.4). Грей и Макленнан предположили, что соматические мутации возникают в быстро делящихся В-клетках центра размножения. «Успешные» мутанты, способные связываться с антигеном и конкурировать за его молекулы, которые проявляются в комплексе антиген—антитело на ФДК, выживают, остальные гибнут. В то время это было очень смелое предположение, объясняющее созревание аффинности. В нем объединялись быстрое соматическое мутирование и связанный с антигеном процесс отбора, спасающий от гибели тех мутантов, которые успешно конкурируют за антиген на ФДК в силу высокой аффинности нового мутантного антитела.

За пять лет группа под руководством Гарнета Келсо, Клауса Раевского (Rajewsky) и Клаудии Берек (Berek) доказала правильность некоторых предсказаний Грея-Макленнана. Оказалось, что соматические мутации перестроенных V(D)J-генов действительно происходят в В-клетках центра размножения. Келсо и Раевский пошли еще дальше, продемонстрировав, что в делящихся В-клетках, которые не были в центре размножения, V(D)J-участок не мутирует. Это означает, что критический сигнал, активирующий «мутатор», находится в центре размножения. Примерно в то же время Йан Макленнан и его группа установили, что, если у потомков В-клетки особой обработкой вызвать сшивки мутантных Ig-молекул (этот процесс имитирует связывание антигена), то такие клетки не умирают.

Итак, к 1991 г. центры размножения представлялись как участки лимфоидной ткани, в которых активно идет соматическое гипермутирование — регулируемый процесс, связанный с анти-гензависимым отбором. Мы хотим подчеркнуть, что центр размножения и у человека, и у мыши развивается только в результате развития иммунного ответа на чужеродный антиген. Важнейшие события, происходящие в центрах размножения, приведены на рис 5.4.

Экспериментальные данные позволяют воссоздать картину возникновения центра размножения во времени и пространстве. В кровотоке в результате связывания с чужеродным антигеном происходит отбор В-клетки. После этого она мигрирует в лимфоидные зоны селезенки или лимфатических узлов. Затем, получив особый сигнал от хелперной Т-клетки, она начинает делиться. Эти активированные В-клетки продуцируют антитела, которые образуют комплексы антиген-антитело на поверхности фолликулярных дендритных клеток (ФДК). Несколько потомков исходной отобранной В-клетки заселяют особые участки лимфоидной ткани, содержащие ФДК, которые называются первичными фолликулами. Одна или несколько из этих клеток-основателей начинают быстро делиться (на рис. 5.4 они названы В-центробластами); на их поверхности нет антител.

Фаза пролиферации (деление клеток каждые пять-семь минут в течение примерно пяти дней) приводит к образованию популяции численностью порядка 20 тысяч дочерних клеток, которые называются центроцитами. Они прекращают деления, и на их поверхностной мембране снова появляются антитела. На каком-то этапе образования популяции центроцитов происходит гипермутирование перестроенных V(D)J-генов. Теперь центр размножения созрел, и сложная постантигенная структура содержит В-центроциты, хелперные Т-клетки и ФДК. Последние образуют развитую сеть комплексов антиген—антитело, включающих антитела, синтезированные в первые дни ответа (см. рис. 5.4).

Затем, по-видимому, происходят следующие события. Во-первых, тысячи центроцитов составляют гигантский репертуар клеток, поверхностные антитела которых кодируются соматическими мутациями. Большинство этих антител (примерно 80%) не способны связывать антиген. Как и для любых других белков, большинство мутаций приводит к изменению формы антитела, а это нарушает соответствие форме антигена. Однако некоторые редкие мутации могут приводить к антителам, лучше соответствующим форме антигена, чем исходные (т. е. с более высокой аффинностью). Новые антитела расположены на поверхности В-центроцитов и могут конкурировать за молекулы антигена, расположенные в комплексах антиген—антитело на поверхности фолликулярных дендритных клеток. Однако для того, чтобы успешно конкурировать с антителом из комплекса (образованным в первые дни ответа), новое мутантное антитело должно иметь ту же или большую аффинность. Вот суть механизма созревания аффинности — конкурентный антигенсвязы-вающий отбор. Центр размножения — это недолговечный «орган селекции и разведения» V(D)J-генов, где выживают только наиболее приспособленные В-клетки. Неудачные (с низкой аффинностью, нефункциональные) мутантные В-клетки (а их большинство) исчезают в результате запрограммированной клеточной гибели, которая называется апоптозом.

Итак, клональная селекция В-клеток происходит в два этапа. На первом чужеродный антиген отбирает В-лимфоцит из популяции разнообразных клеток. Затем эти В-центробласты быстро делятся, образуя популяцию в 20 тысяч новых В-клеток, имеющих мутантные вариабельные V(D)J-области. На втором этапе мутантные линии В-клеток с высокой аффинностью отбираются антигеном, выживают, делятся и секретируют антитела высокой аффинности или становятся долгоживущими клетками памяти. В этом нет ничего мистического. Это традиционный дарвиновский отбор, действующий в большой изменчивой клеточной популяции, из которой выживают немногие — только те, которые продуцируют мутантные антитела с наивысшей аффинностью к антигену. Центр размножения, следовательно, — котел, в котором «варится» генетическая гипервариа-бельность. Однако все процессы в нем строго регулируются и контролируются. V(D)J-гены (только эти гены, а не другие) В-лимфоцитов мутируют в высоко специализированной и регулируемой среде центра размножения.

До сих пор мы подчеркивали значение дарвиновского естественного отбора в иммунной системе. Однако мы ввели и определенно неоламаркистскую идею, а именно, роль сигнала внешней среды (антигена) в создании генетического разнообразия, на которое действует естественный отбор. Может ли этот ключевой эволюционный вывод вызвать такие же споры, которые были вызваны идеей «разнообразия, вызванного антигеном», впервые предложенной Элистэром Каннингемом в середине 1970-х гг.?