Глава 7 «Маленькое» отличие

Глава 7

«Маленькое» отличие

После того как я познакомил читателя с передающимися по наследству вариациями в химическом составе красной клетки, мы можем идти дальше. К примеру, гемоглобин может существовать в нескольких разновидностях, которые также передаются по наследству, и обладание некоторыми из них иногда чревато серьезными последствиями.

У подавляющего большинства людей в крови находится обычный гемоглобин. По всей вероятности, между моим гемоглобином и вашим химики не найдут никакой разницы. Этот нормальный и обычный гемоглобин называется гемоглобином А.

Красные клетки в крови плода содержат гемоглобин, слегка отличающийся от обычного. У этих двух гемоглобинов разные электрические свойства, что требует дальнейшего обсуждения.

Все белки имеют электрические заряды, локализованные в разных точках на поверхности их больших молекул. Существует два типа электрического заряда — положительный и отрицательный, и все белки обладают обоими типами. Эти заряды, объединяясь, составляют суммарный заряд молекулы. Он считается положительным, если на белке больше положительных зарядов, чем отрицательных, и отрицательным — в обратном случае. Он также может быть нулевым, это значит, что молекула несет равное количество положительных и отрицательных зарядов.

Если через раствор белка пропустить электрический ток, молекулы с суммарным положительным зарядом потянутся к отрицательному электроду, а молекулы с отрицательным зарядом — к положительному. Молекулы с нулевым зарядом останутся неподвижны. Скорость передвижения белковых молекул зависит от их размера и формы, от величины суммарного заряда и распределения положительных и отрицательных зарядов на их поверхности. Существует множество комбинаций этих параметров, и поэтому можно быть уверенным, что две различные молекулы будут передвигаться с различной скоростью под влиянием электрического поля.

Близкородственные молекулы белка, которые, кажется, обладают одинаковыми характеристиками, могут обладать совершенно разными зарядами и передвигаться на различных скоростях. Если раствор с молекулами различных белков подвергнуть воздействию электрического поля, то одни молекулы станут передвигаться быстрее, чем другие, и оба вида начнут разделяться, подобно двум группам бегунов на беговой дорожке, когда одна группа вырывается вперед другой.

Процесс, позволяющий похожим белкам разделяться в соответствии со скоростями движения в электрическом поле, называется электрофорезом. Был изобретен сложный аппарат, при помощи которого химики могут следить за процессом разделения по небольшим изменениям в преломлении световых лучей, проходящих через белковый раствор в различных точках. Позднее удалось создать более простую версию этого прибора, в котором белки двигались по листу пористой бумаги, смоченной в растворе. Это электрофорез на бумаге.

Гемоглобин в красных клетках плода, отличающийся по электрофоретической подвижности от нормального гемоглобина, называется фетальным гемоглобином или гемоглобином F.

Еще одно различие между гемоглобином А и F заключается в том, что последний более прочно захватывает кислород. Если смешать растворы гемоглобина А и F и подвергнуть их воздействию кислорода, то гемоглобину F достанется львиная доля.

Ясно, что это происходит ради нормального развития плода, который, находясь в утробе, зависит от того, сколько молекул кислорода просочится через плацентарную оболочку из крови матери. Эритроциты матери с гемоглобином А находятся по одну сторону оболочки, а красные клетки плода с гемоглобином F по другую сторону. Поскольку гемоглобин F более крепко присоединяет молекулы кислорода, на плодной стороне плаценты бывает меньше свободного кислорода, чем на материнской. Так как кислород будет переходить из области высоких концентраций в область более низких, мать будет отдавать свой кислород плоду.

Тем не менее почти с самого начала развития плод учится пользоваться гемоглобином А, готовясь к самостоятельной жизни. Когда ему исполняется двадцать недель, одну шестнадцатую часть его гемоглобина составляет гемоглобин А. Когда проходит девять месяцев и ребенок появляется на свет, одну пятую часть его молекул гемоглобина составляет гемоглобин А. Через четыре месяца после рождения гемоглобин F почти полностью исчезает.

Как бы ни был полезен плоду гемоглобин F, очевидно, он не столь полезен взрослому. Иногда человек может наследовать от одного из родителей дефектный ген (или ген может стать таковым по стечению обстоятельств во время образования сперматозоида или яйцеклетки), который не в состоянии эффективно выполнять свою задачу по контролю за выработкой гемоглобина А. Тогда у человека остается только один нормальный ген: помните, что у каждого из нас по два гена, отвечающих за определенный признак, один от матери, другой от отца. Фактически один ген может выполнять работу обоих, но не всегда. Организм способен существовать, вырабатывая слишком мало гемоглобина А и удовлетворяя свои потребности гемоглобином F. (Любой человек может вырабатывать гемоглобин F в чрезвычайных ситуациях, подобных этой, иначе он никогда бы не выжил во время внутриутробного развития.) Это состояние, которое называется малой талассемией, не представляет угрозы для жизни.

Однако человек может унаследовать дефектный ген и от матери, и от отца. У этого несчастного ни один ген не в состоянии вырабатывать гемоглобин А. Количество гемоглобина F в красных клетках может достигать 100 %. В этом случае развивается большая талассемия, и обычно она заканчивается летальным исходом еще в раннем возрасте.

Известны и другие виды аномальных молекул гемоглобина. В 1910 году Джеймс Б. Херрик, осматривая двадцатилетнего негра из Вест-Индии, обнаружил в его крови красные клетки необычной формы. Они изгибались, подобно острию серпа, и ученый назвал их серповидными эритроцитами. После этого и у других людей, также чернокожих, были обнаружены подобные клетки. К 1928 году выяснили, что это наследственное заболевание и красные клетки приобретают серповидную форму, когда концентрация кислорода в крови ниже нормальной.

В 1949 году американский химик Лайнус Полинг и его коллеги выяснили, что красные клетки приобретают такую форму из-за содержания в них необычного гемоглобина, названного ими гемоглобином S (от слова «серповидный»). Эту разновидность гемоглобина легко выявить при помощи электрофореза. Гемоглобин F передвигается медленнее в электрическом поле, чем гемоглобин А, а гемоглобин S — еще медленнее.

Очевидно, главная проблема с гемоглобином S заключается в том, что он менее растворим, чем гемоглобин А или F; в условиях организма растворяется только одна двадцать пятая его часть. Он упакован в красных клетках довольно плотно, и в них едва хватает места для жидкости, чтобы он мог свободно плавать, при условии, что это растворимый гемоглобин А или F. Если часть гемоглобина представлена гемоглобином S, то последний образует маленькие твердые кристаллы. Они выпячиваются сквозь мембраны красных клеток и искажают их, придавая клетке серповидную форму. Оксигемоглобин S так же растворим, как оксигемоглобин А, поэтому искажение происходит лишь в том случае, когда содержание кислорода в крови уменьшается и оксигемоглобин S превращается в гемоглобин S.

Если бы красные клетки постоянно сохраняли свою серповидную форму, случилась бы беда. Они не только хуже присоединяют кислород, их искаженная оболочка необычайно хрупка, поэтому такая клетка разрушается быстрее нормальной. В результате развивается анемия.

К счастью для людей с одним геном гемоглобина S (к ним относятся большинство негров, чьи красные клетки можно превратить в пробирке в серповидные), образование аномальных клеток в обычных условиях происходит в организме редко. Такие люди могут вести обычную жизнь и жить не меньше, чем здоровые.

Опасение вызывает будущее ребенка, унаследовавшего оба гена гемоглобина S. Поскольку у него нет генов гемоглобина А, он его совершенно не вырабатывает, вместо этого вырабатывается гемоглобин S и, возможно, немного гемоглобина F. У таких детей красные клетки имеют серповидную форму даже при обычных условиях, вследствие чего развивается серповидноклеточная анемия, которая обычно заканчивается смертью в раннем возрасте.

Почему же гемоглобин S встречается только в организме негров? Как он образуется? Иногда ген может не передаваться по наследству. В процессе формирования сперматозоида или яйцеклетки часть химической структуры гена может случайно измениться. Его структура очень сложна, и во время часто повторяющихся воспроизводств этой структуры случаются ошибки и просчеты. Измененный ген может вместо гемоглобина А производить гемоглобин S. Изменение гена, которое приводит к появлению у ребенка нового признака, отсутствующего у его родителей, называется мутацией.

Мутации происходят не очень часто. Возможно, если говорить о данном случае, она произошла много поколений назад у какого-нибудь африканского негра и больше не повторялась, а в наше время проявляется только у тех, чьи гены имеют отношение к генам их далекого предка, то есть у негров.

Тропическая Африка — центр сосредоточения гена S, и гемоглобин S встречается там намного чаще, чем в остальном мире. Американские негры наследуют ген S от своих африканских предков, но, из-за того что их кровь в значительной степени смешалась с кровью американцев, ген гемоглобина S стал более «разбавленным» и встречается реже. Но все же у одного из одиннадцати афроамериканцев присутствует ген гемоглобина S, поэтому в крови обнаруживаются серповидные изменения клеток. Наличие их в малых количествах не причиняет вреда, и это состояние не следует путать с серповидноклеточной анемией. Лишь один из пятисот американских негров, имеющих ген S, страдает от этого заболевания.

Если среди некой популяции существует определенное количество гена S, то можно ожидать, что постепенно этот ген исчезнет. Когда у человека встретятся два таких гена, то он умрет прежде, чем успеет передать их своим детям. Это касается двух генов. Медленное, но постоянное выбывание гена истощит постепенно его количество в данной популяции. При обычных обстоятельствах так бы и произошло. Но ген S по-прежнему существует. Возможно, мутация, приведшая к появлению гена гемоглобина S, произошла не в Африке, а где-то еще, где ген полностью исчез. Возможно, она случайно возникла исключительно в Африке и там нашла подходящие условия для развития. Если так, то какие это условия?

Один ключ к разгадке был со временем найден. В регионах, где часто встречается ген S, также часты случаи малярии. Похоже, люди с одним геном S менее подвержены малярии. Возможно, малярийному вирусу, инфицирующему красные клетки людей и паразитирующему в них, приходится не по вкусу гемоглобин S. По этой причине люди с геном S в среднем живут дольше и отличаются более крепким здоровьем, тем самым у них больше времени, чтобы родить много детей.

В итоге невосприимчивость к малярии у людей с одним геном S приводит к тому, что такой ген встречается в популяции значительно чаще. Возможность умереть от двойной порции генов эту вероятность снижает. В результате образуется некоторое равновесие. Встречаемость гена S высока там, где свирепствует малярия, и низка в местах, где ее нет.

Возможно, если современной медицине удастся разработать новые способы контроля численности насекомых и поднять уровень гигиены в пораженных болезнью районах Африки, случаи заболевания малярией и рождение людей с геном S уменьшатся. Однако мы не вправе утверждать это с полной уверенностью, поскольку, возможно, дело не только в малярии.

После открытия гемоглобина S на свет появилась целая серия гемоглобинов, и трудно сказать, будет ли ей когда-нибудь конец. Возможно, что и нет. Обычно эти разновидности гемоглобина отличаются по своим электрофоретическим свойствам и обозначаются буквами. Пока кроме гемоглобина А, F и S обнаружены гемоглобины С, D, E, G, Н, I, J, К, L, М.

Гемоглобины G, Н, I, J, К, L, М обнаружены пока только у одной или двух семей, и об этих видах практически ничего не известно, кроме того, что они существуют. Так же как гемоглобин С, D, Е и S, они управляются генами — аллелями обычного гена гемоглобина. Если в вашем организме есть аномальный ген гемоглобина, то он занимает место нормального. Это несправедливо по отношению к гемоглобину F, который является аллелем гемоглобина А. Не важно, каково состояние ваших обычных генов гемоглобина, у вас все равно есть один нетронутый ген F, иначе вам бы не удалось выжить во время внутриутробного существования.

Из других аномальных видов гемоглобина у жителей северной Индии у 1 % населения встречается гемоглобин D.

Гемоглобин С чаще всего встречается у африканских негров, так же как и гемоглобин S. Однако гемоглобин С более редок и отмечен только в Западной Африке, а не в тропических ее районах, характерных для распространения гемоглобина S. Самое высокое содержание гемоглобина S выявлено в северных областях Ганы (бывший Золотой Берег). Гемоглобин С составляет там около 28 % всех генов гемоглобина.

Как и в случае с гемоглобином S, один ген С (или любой другой) не представляет опасности. Возможно, гемоглобин С даже защищает от малярии, и есть данные, что этот ген появился в результате недавней мутации и распространяется за пределы пораженных малярией районов. Встречаются редкие случаи, когда ребенок может наследовать два разных гена аномального гемоглобина: гемоглобин S и С. Это очень плохо и обычно приводит к смерти в раннем возрасте.

Гемоглобин Е чаще встречается в Юго-Восточной Азии. В Таиланде он составляет 13 % генов гемоглобина. В столице Индонезии Джакарте он составляет 6 % от всех генов. Идут споры о том, позволяют ли единичные гены D и Е организму более эффективно усваивать железо и тем самым обходиться меньшим его количеством.

Если это действительно так, то создается следующая картина. Аномальные виды гемоглобина появляются постоянно из-за случайных изменений (мутаций) генов гемоглобина. Почти всегда аномальный гемоглобин не столь эффективен, как обычный, и если не существует уравновешивающих недостатки преимуществ, а обычно их нет, то по истечении времени такой ген вымирает. Возможно, недавно обнаруженные виды аномального гемоглобина как раз из этой категории: мутации произошли недавно, и через несколько поколений такие гены могут исчезнуть.

С другой стороны, если один ген аномального гемоглобина позволяет людям более эффективно справляться с недоеданием или болезнями, как в случаях с генами С, D, Е и S, то они могут сохраниться за счет баланса своих достоинств и недостатков, если на достижение такого баланса хватит времени. Тогда аномальные гены чаще всего должны возникать в районах с низким уровнем жизни, а это так и происходит. Конечно, если аномальные гены будут проявляться чаще гена гемоглобина А, то последний может также исчезнуть.

Естественно, ученым было любопытно узнать, чем именно отличаются различные виды гемоглобина. При электрофорезе они ведут себя по-разному, следовательно, должны быть химические различия, однако выяснить это оказалось нелегким делом.

Обычные способы анализа белков показали, что химический состав гемоглобина А и S почти одинаков. Во всяком случае, не было выявлено никаких отличий. Однако каждая молекула состоит примерно из 8000 атомов. Если удалить или расположить по-другому всего несколько атомов, то в молекуле могут произойти изменения, хотя среди тысяч атомов нелегко выявить несколько расположенных в другом порядке.

Тем не менее, кажется, сейчас проблема уже решена.

Во-первых, атомы молекул белков расположены не в случайном порядке. Они располагаются маленькими группами, образуя соединения под названием аминокислоты, которые, в свою очередь (к сожалению), располагаются совершенно непредсказуемым образом. Существует девятнадцать различных аминокислот, из которых состоят почти все белки, и примерно столько же, которые встречаются только в некоторых белках. В молекуле гемоглобина нет необычных аминокислот — только девятнадцать обычных.

Молекула гемоглобина состоит примерно из шестисот аминокислот. Одна аминокислота в ней встречается около семидесяти пяти раз, другая — всего один раз, а остальные количественно представлены примерно равномерно. Поскольку они не расположены в повторяющемся порядке, проблема определения, где находится какая аминокислота, кажется неразрешимой. Число возможных комбинаций аминокислот в молекуле гемоглобина более чем 10⁶¹⁹, то есть единица с 619 нулями. Это порядочное количество. Как в нем разобраться?

Известно, что каждая молекула гемоглобина состоит из двух одинаковых частей, поэтому можно узнать расположение только трехсот аминокислот в половине молекулы, но и это тоже непросто. Молекулу необходимо расщепить на более мелкие части.

Вернон М. Ингрэм из Кембриджского университета сделал это, обработав молекулу гемоглобина пищеварительным ферментом — трипсином. Трипсин вызывает расщепление цепи аминокислот в тех местах, где расположены аминокислоты лизин и аргинин. В результате половина молекулы гемоглобина распадается на двадцать восемь фрагментов.

Эти фрагменты представляют собой короткие цепочки аминокислот, которые называют пептидами. Некоторые пептиды могут состоять всего из двух или трех аминокислот, другие — из дюжины или больше, в зависимости от расположения групп лизина и аргинина в исходной цепочке. Естественно, все двадцать восемь пептидов смешаны между собой, и их нужно разделить.

Для этого каплю смеси помещают на пористую бумагу (фильтровальную бумагу, которая первоначально использовалась в химических лабораториях для фильтрования — отделения твердых частиц от жидкости), которую затем смачивают нужным раствором. К ней прикрепляют два электрода и через бумагу пропускают электрический ток. Пептиды, подобно протеинам, устремляются к положительному или отрицательному электроду с разной скоростью, которая зависит от степени электрического заряда каждого пептида. Это и есть электрофорез на бумаге, о котором я уже упоминал.

В результате этого процесса пептиды делятся на несколько групп и распределяются в виде пятен по бумаге. Эти пятна нельзя рассмотреть невооруженным глазом, но их можно увидеть, если прибегнуть к некоторым манипуляциям. Бумагу можно обработать химическим составом, который вступит с пептидами в реакцию, в результате которой образуются окрашенные соединения. Или можно использовать ультрафиолетовые лучи, чтобы обычно невидимые вещества, поглотив их, проступили в виде темных пятен, стали черными или, наоборот, стали светиться. В каждом пятне локализовано несколько пептидов с одинаковыми электрическими свойствами, поэтому эти пептиды нужно разделять дальше. Это делается при помощи хроматографии, о которой стоит поговорить особо.

Хроматографию изобрел в 1906 году русский ботаник Михаил Цвет. Он хотел разделить различные пигменты из листьев растений. Эти пигменты были настолько схожи по химическому составу, что обычные методы разделения были не эффективны. Тогда Цвет использовал совершенно новый способ.

Он приготовил из смеси пигментов раствор и вылил его в колонку, наполненную измельченным известняком. Пигменты прикрепились к поверхности крошечных частиц в верхнем слое известняка, а жидкость, в которой они были растворены, прошла по колонке вниз и вышла из нее. Первоначально окрашенный раствор вышел бесцветным, а в верхней части колонки осталась цветная полоска пигмента.

Затем Цвет пропустил через колонку другую жидкость — петролейный эфир. Эфир медленно вымывал пигмент из известняка. Причем каждый пигмент вымывался с различной скоростью. Те, которые связывались с известняком слабо (или очень хорошо растворялись в петролейном эфире), вымывались довольно быстро; те, которые связывались более прочно (или плохо растворялись в эфире), вымывались медленнее. Со временем исходная смесь пигментов была разделена на несколько цветных полос, в каждой из которых находился отдельный пигмент. Эти полосы можно было полностью вымыть из колонки и исследовать по отдельности.

Цвет назвал свой метод хроматографией, от греческих слов, означающих «цветное письмо», потому что состав смеси вырисовывался в виде цветных поперечных полос, располагающихся вдоль колонки. Естественно, этот метод применим и к бесцветным соединениям.

Много лет метод Цвета не получал признания, потому что первый доклад ученого был напечатан в довольно плохом немецком ботаническом журнале, а последующие доклады Цвета были на русском языке. Он был всего-навсего русским ботаником, и немецкие биохимики, правящие в науке в те времена, не обращали на него внимания. Однако в 1931 году немецкий биохимик Рихард Вильштеттер наткнулся на описание этого метода и начал его использовать. После этого хроматография получила широкое распространение.

Кроме известняка, в качестве наполнителя колонки использовались и другие измельченные вещества: окись алюминия, крахмал, позже стали применять ионообменные смолы. Смолы представляют собой ломкие вещества янтарного цвета, состоящие из крупных молекул, в состав которых входит бесчисленное количество групп атомов. Эти атомы в результате химических реакций способны в одних условиях соединиться с определенными видами молекул и, наоборот, отсоединяться от них в других условиях. Смолы разного состава обладают большим разнообразием свойств и поэтому подходят для многих видов исследований. Некоторые даже могут опреснять воду. Морскую воду пропускают через колонку со смолой и получают питьевую воду.

Большой шаг вперед был сделан в 1944 году, когда группа британских биохимиков из Кембриджского университета показала, что разделение смеси веществ на составляющие компоненты можно производить на фильтровальной бумаге. Вместо того чтобы пропускать растворитель через колонку, заполненную измельченным веществом, они смачивали им фильтровальную бумагу. Растворитель поднимался (или спускался) по бумаге, проходил то место, куда наносили каплю исследуемой смеси, и распространялся по бумаге дальше, увлекая за собой компоненты смеси, которые двигались с различной скоростью. В результате одно пятно смеси превращалось в несколько, каждое из которых соответствовало отдельному компоненту. Такой способ получил название бумажной хроматографии и сегодня является одним из часто применяемых методов из методического арсенала биохимиков. Почти каждое исследование завершается разделением смеси или очисткой отдельного вещества при помощи бумажной хроматографии.

Вернемся теперь к доктору Ингрэму и пептидной смеси, полученной при расщеплении гемоглобина.

Мы остановились на полученных с помощью электрофореза на бумаге пятнах, в каждом из которых находилось несколько пептидов. Затем он провел бумажную хроматографию пятен: смочил бумагу раствором, разделил их на «подпятна».

Когда все было сделано, на фильтровальной бумаге образовалось двадцать восемь отдельных пятен. Ингрэм пронумеровал каждое и проделал то же самое, только на этот раз с гемоглобином S, а не с гемоглобином А. При разделении фрагментов гемоглобина S у него также получилось двадцать восемь пятен.

Можно сказать, что он взял у каждой молекулы «отпечатки» и теперь ему оставалось их сравнить. Оказалось, что они у молекул гемоглобина А и S были одинаковы, за исключением одного пятна. Пятно под номером 4 в образце гемоглобина S отчетливо переместилось влево по сравнению с аналогичным пятном гемоглобина А.

Доктор Ингрэм неоднократно повторил эксперимент с обоими видами гемоглобина, каждый раз вырезая пятно номер 4, вымывал пептид из бумаги, пока не собралось достаточное количество материала. Конечно, это занятие было утомительным, но совершенно необходимым.

Под четвертым номером оказался пептид, состоящий из девяти аминокислот. Пептид расщеплялся при помощи соляной кислоты вначале на более мелкие фрагменты, а затем на отдельные аминокислоты. Те, в свою очередь, тоже разделялись и исследовались, и, наконец, Ингрэму удалось определить расположение аминокислот в четвертом пятне гемоглобина А. Он был таков: гистидин — валин — лейцин — лейцин — треонин — пролин — глутаминовая кислота — глутаминовая кислота — лизин (это названия различных аминокислот).

Расположение в гемоглобине S было следующим: гистидин — валин — лейцин — лейцин — треонин — пролин — валин — глутаминовая кислота — лизин.

Если вы сравните два списка, то увидите, что в них только одно различие. В том месте, где у гемоглобина А находится глутаминовая кислота, у гемоглобина S находится валин. Насколько нам сегодня известно, это единственное различие между двумя молекулами: несоответствие двух аминокислот из шестисот (по одной в двух одинаковых частях гемоглобина).

Один из коллег доктора Ингрэма, Джон Хаит, проделал тот же эксперимент с гемоглобином C, и в этом случае четвертое пятно оказалось другим. Его расчленили на два фрагмента. В гемоглобине C на месте глутаминовой кислоты, которая присутствовала в гемоглобине А, или валина — в гемоглобине S, оказался лизин. Поскольку фермент трипсин, используемый для расщепления молекулы на две части, атакует пептид в том месте, где находится лизин, четвертое пятно в гемоглобине С разделилось на два пептида, один из семи аминокислот и один из двух.

Теперь стало понятно, что было причиной различного поведения пептидов при электрофорезе. Глутаминовая кислота гемоглобина А несет отрицательный заряд. У валина в гемоглобине S заряда нет. Лизин в гемоглобине С имеет положительный заряд. В итоге заряды у каждого пептида различны, поэтому в электрическом поле они ведут себя по-разному.

Конечно, как и все, это громкое открытие немедленно вызвало новые вопросы. Почему такое ничтожное изменение состава молекулы гемоглобина так сильно влияет на его растворимость, устойчивость человека к малярии и тому подобное? Как гены влияют на состав молекулы? Как им удается контролировать соединение шести сотен аминокислот? И что может произойти с геном и заставить его изменить всего одну аминокислоту в молекуле белка?