1.2.7. Формалин

Формалин – наиболее распространенная и универсальная фиксирующая жидкость. Формалин хорошо проникает в ткани и потому применяется для фиксации довольно крупных объектов. Формалин придает ткани плотность, вполне подходящую для резки на замораживающем микротоме и вибратоме. Существенное преимущество формалина состоит в том, что препараты можно хранить в нем годами, у них сохраняется способность к окрашиванию наиболее часто используемыми методами (гематоксилинэозином, по Ван-Гизону). Особенно ценной является способность формалина хорошо сохранять липиды, что важно для фиксации нервной ткани. Фиксация чистым формалином менее пригодна для различных цитологических исследований, например для ядерных структур, для органов кроветворения, для обнаружения гликогена или железа. Недостатками формалина являются:

– ухудшение окраски тканей при продолжительной фиксации и хранении «влажного архива»;

– возможность выпадения формалиновых осадков;

– сильное маскирующее действие на большинство антигенов, выявляемых иммуноцитохимически.

Для приготовления формалинового фиксатора используют готовый 35 – 40 % водный раствор формальдегида (альдегида муравьиной кислоты). Следует учитывать, что концентрированный раствор формальдегида обычно содержит метиловый спирт (около 10 %), который добавляют для стабилизации раствора и предотвращения полимеризации формальдегида. Формалин следует хранить в защищающих от света коричневых склянках при температуре не ниже 9 °C. При более сильном охлаждении в растворе появляется муть, которая постепенно оседает в виде белого осадка (параформальдегид и триоксиметилен). При длительном хранении раствор формальдегида медленно окисляется, происходит накопление муравьиной кислоты.

В большинстве случаев препараты удовлетворительного качества можно получить при использовании в качестве фиксирующей жидкости обычного (кислого, не нейтрализованного) 10 %-го формалина. Его готовят из концентрированного раствора формальдегида, добавляя к одной его части 9 частей водопроводной воды. Не следует использовать формальдегид с белым осадком. Часто рекомендуемый способ растворения осадка путем нагревания в вытяжном шкафу на практике мало применим. При появлении незначительного осадка в емкости с концентрированным раствором формальдегида следует уменьшить его разведение (1: 6 вместо 1: 9). При наличии значительного осадка раствор формальдегида становится непригодным для использования (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Определение концентрации формалина в растворе представляется затруднительной задачей. Существующий метод титрования описан у Б. Ромейса (1954), однако он чрезвычайно сложен и поэтому не может быть рекомендован для практических целей. Упростить решение этой задачи позволяет специальная индикаторная бумага, выпускаемая фирмой Sakura (Япония).

При необходимости использования нейтрального раствора формалина (для фиксации нервной ткани, при применении специальных окрасок, при проведении иммуноцитохимического исследования) его готовят следующим образом: раствор формальдегида (37 – 40 %) – 100 мл, вода дистиллированная – 900 мл, однозамещенный фосфат натрия – 4 г, безводный двузамещенный фосфат натрия – 6,5 г. Этот раствор стабилен при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Использование нейтрального формалина позволяет существенно уменьшить вероятность отложения формалиновых осадков, появление которых обусловлено взаимодействием гемоглобина с кислыми растворами формалина (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Нейтрализация формалина по Б. Ромейсу. Формалин оставляют надолго в коричневой склянке над слоем порошкообразного углекислого кальция толщиной 1 – 2 см. Вначале склянку несколько раз энергично взбалтывают. Обычно кислота достаточно нейтрализуется уже через 24 ч.

Если нейтрализация формалина не производится, то его следует развести до нужной концентрации заранее, а не в день фиксации. Этот прием улучшает качество фиксации.

Кусочки органов толщиной 0,5 – 1,0 см фиксируются в 10 – 20 %-м растворе формалина в течение 24 – 48 ч. Спустя сутки раствор меняют. Более длительная фиксация нежелательна. Критерием достаточной фиксации служит равномерное уплотнение объекта как с поверхности, так и выявляемое на контрольном разрезе. В центральной части не полностью фиксированных кусочков ткань сохраняет красно-розовый цвет. Фиксацию в формалине проводят при комнатной температуре (Коржевский Д. Э. [и др.], 2010).

Формалин-пиридин. Рекомендуется следующий раствор: дистиллированная вода – 75 мл, формалин – 25 мл, чистый пиридин – 5 мл. Количество фиксирующей жидкости должно превышать объем препарата по крайней мере в 20 раз. Продолжительность фиксации – 48 ч. Периферические нервы лучше фиксировать 2 нед. (допустимо и 6 нед.), не должно быть никаких осадков формалина. После этой фиксации применимы все обычные методы окраски и импрегнации. Этот метод фиксации рекомендован для тех случаев, когда предписывается нейтральный формалин. рН формалин-пиридина – около 7,0 – 7,5 (Ромейс Б., 1954).

Формалиновые осадки. Очень часто в фиксированных формалином препаратах появляются темно-коричневые кристаллические осадки, которые образуются в результате взаимодействия формальдегида с гемоглобином (Ромейс Б., 1954). Чаще всего они обнаруживаются в области кровоизлияний и над просветами кровеносных сосудов, заполненных эритроцитами. По цвету формалиновые осадки невозможно отличить от скоплений гемосидерина, что затрудняет диагностическую оценку препарата.

Метод Кардазевича. Удаление осадков лучше всего производится путем помещения неокрашенных срезов в 1 – 5 % раствор нашатырного спирта (NН₄ОН) в 70 %-м этиловом спирте. Время исчезновения осадков варьирует от 5 мин до 4 ч. Cтруктура и окрашиваемость объекта остаются неизмененными. Этот метод превосходит часто употребляющийся метод Верокая. Единственный недостаток этого способа состоит в том, что, кроме формалинового осадка, растворяется и малярийный пигмент. Остальные пигменты, прежде всего липофусцин, меланин, гемосидерин, антракотический пигмент, не растворяются (Ромейс Б., 1954).

Метод Верокая. Для освобождения от формалиновых осадков срезы помещают на 10 мин в смесь 1 части 1 %-го водного раствора едкого калия и 100 частей 80 %-го спирта, затем на 5 мин – в дважды сменяемую воду, на 5 мин – в 80 %-й спирт, после чего промывают в проточной воде (Ромейс Б., 1954).

Размягчение перефиксированных препаратов. Если вследствие длительного пребывания в крепком формалиновом растворе препараты станут слишком плотными, то избыточную плотность можно устранить помещением их на 14 дней в 1 %-й раствор азотнокислого серебра или в 10 %-й раствор лимонной кислоты (Ромейс Б., 1954).

Формалин часто комбинируют с другими фиксирующими жидкостями, причем непосредственно перед употреблением, так как жидкости, особенно если они содержат окислители, после смешения достаточно быстро изменяют свои свойства из-за окисления формальдегида.

Данный текст является ознакомительным фрагментом.