Глава 14  Молекулярная биология. нуклеиновые кислоты

We use cookies. Read the Privacy and Cookie Policy

Глава 14

 Молекулярная биология. нуклеиновые кислоты

Вирусы и гены

Как только молекулы протеина вошли под контроль науки, неожиданно обнаружилось, что на роль первородных кирпичиков жизни претендуют совсем иные, нежели предполагали ученые, структуры. Эти структуры вышли на авансцену при исследовании вопроса фильтрующихся вирусов.

Природа вирусов оставалась загадкой для многих поколений. Известно, что они вызывают заболевания, поэтому были разработаны методы противостояния вирусам; однако сам факт, а не его эффекты оставался неизвестным. Как только были разработаны достаточно тонкие фильтры для удержания вирусов, удалось оценить частицы вирусов: чем бы они ни были, даже принимая во внимание тот факт, что они мельче, чем самые мелкие из известных в природе клеток, они все равно больше, чем самые крупные из молекул протеинов. Итак, было решено, что вирусы — это структуры, промежуточные между клетками и молекулами.

Электронный микроскоп открыл их для нас как объекты, которые можно рассмотреть и оценить. Они бывают самых разных размеров: от крошечных точек не более чем большая молекула протеина до структур с регулярными геометрическими формами и очевидной внутренней организацией. Бактериофаги занимают нишу среди самых крупных вирусов. Микроорганизмы, именуемые рикеттсиями (по имени исследователя Рикеттса), крупнее вирусов размером и все же меньше самых малых бактерий.

В свое время стоял вопрос о том, являются ли эти организмы, заполняющие нишу между самыми мелкими из клеточных структур и самыми крупными из молекулярных, живой частью природы или неживой. В 1935 г. была выдвинута потрясающая гипотеза. Американскому биохимику Уэнделлу Мередиту Стенли при работе с экстрактом вируса табачной мозаики удалось получить крошечные игольчатые кристаллы. Они, будучи изолированными, обладали всеми инфекционными свойствами вируса, только в более высокой концентрации. Другими словами, был получен вирусный кристалл — либо кристаллический вирус, — что одинаково трудно было принять.

Вирус, гораздо более мелкий, чем клетки, не обладал способностью к независимой жизни. Однако вирус может проникать внутрь клетки и воспроизводить самого себя как живое существо.

Не существует ли в самой клетке некоего субклеточного компонента, который составил бы сущность жизни? Быть может, вирус гораздо более мелок, чем клетка, ввиду того, что когда-то он составлял часть клетки?

Если так оно и есть, то, какие субклеточные компоненты должны быть локализованы в нормальных клетках? На эту роль претендуют хромосомы. В первые годы XX в. стало очевидным, что хромосомы несут факторы, отвечающие за физические характеристики. Однако хромосомы гораздо больше по размерам, нежели вирусы.

Хромосом численно меньше, чем наследуемых характеристик; таким образом, следует сделать заключение, что каждая хромосома составлена из неделимых блоков, которых очень много. Их может быть тысячи — и каждый из них контролирует какую-то характеристику. Эти индивидуальные блоки в 1909 г. датский ботаник Вильгельм Людвиг Иогансен назвал генами — от греческого слова, означающего «дающий жизнь кому-то».

В первых десятилетиях XX в. индивидуальный ген, как индивидуальный вирус, не мог быть увиден и зафиксирован; однако уже тогда ученые работали с ним. Фундаментальные исследования принадлежат американскому генетику Томасу Ханту Моргану (1866 — 1945), который в 1907 г. предложил новый биологический инструмент — а именно крошечную плодовую мушку дрозофилу. Это малое насекомое поддается разведению в больших количествах практически без всяких затрат. В ее клетках находится по четыре пары хромосом.

Прослеживая за генерациями плодовой мушки, Морган открыл бесчисленное множество мутаций, которые ведут к столь же поразительному разнообразию в животном мире, к какому приводило открытие де Ри в мире растений.

Моргану удалось также доказать, что многие характеристики взаимосвязаны, то есть наследуются совместно. Это означало, что гены, отвечающие за эти характеристики, обнаруживаются на одной и той же хромосоме и эта хромосома наследуется как единый блок. Однако характеристики не связаны друг с другом вечно. Одна наследуется без другой. Определенные пары хромосом случайно перекрещивались в ином месте; таким образом, целостность их оказывалась нарушенной.

Подобные эксперименты давали возможность пометить место на хромосоме, где должен был локализоваться определенный ген. Чем больше длина хромосомы, разделяющей два гена, тем больше вероятность того, что при случайном перекрещивании эти гены разделятся. К 1911 г. были разработаны первые хромосомные схемы для дрозофилы.

Один из учеников Моргана, американский генетик Герман Джозеф Мюллер, выработал метод увеличения частоты мутаций. В 1919 г. он обнаружил, что частота мутаций повышается с повышением температуры. Более того, это не было результатом общего перемешивания генов. Всегда обнаруживалось, что один из генов задействован, в то время как его дубликат на другой хромосоме данной пары не затронут. Мюллер склонялся к мнению, что в этом играют роль изменения на молекулярном уровне. Поэтому он решил использовать рентгеновские лучи. Они более энергетичны, чем мягкое нагревание, а также действуют более локализованно. К 1926 г. Мюллер уже мог ясно доказать, что рентгеновские лучи многократно увеличивают мутации. Американский ботаник Альберт Франсис Блейксли в 1937 г. показал, что степень мутаций возрастает под действием специфических химических агентов (мутагенов). Лучшим примером такого мутагена явился колхицин — алкалоид, получаемый из крокуса осеннего (безвременника).

Таким образом, к середине 1930-х годов и вирусы, и гены уже не являлись тайной. И те и другие являли собой молекулы одного и того же размера и приблизительно одного и того же химического состава. Может быть, гены — это «прирученные» вирусы клетки? Может быть, вирус — это «одичавший» ген?

Значение ДНК

Как только были выделены кристаллические вирусы, появилась возможность анализировать их химически. Конечно, они являют собой протеин, однако особую разновидность протеина. Разработка методов меченых атомов сделала возможным исследование химической природы индивидуальных субклеточных структур. Выяснилось, что хромосомы, а, следовательно, и гены, представляют собой нуклеопротеин.

Молекула нуклеопротеина состоит из протеина, связанного с несущим фосфорную составляющую веществом, известным как нуклеиновая кислота. Нуклеиновые кислоты были открыты в 1869 г, швейцарским биохимиком Фридрихом Майшером (1844 — 1895). Впервые эти кислоты были обнаружены в ядре клетки. Позже, когда их обнаружили и вовне ядра, было поздно переименовывать — и они сохранили свое название.

Нуклеиновые кислоты были впервые в деталях исследованы германским биохимиком Альбрехтом Кесселем (1853 — 1927), который в 1880-х годах и позже выделил из нуклеиновых кислот составляющие их блоки. Блоки включали в себя фосфорную кислоту и сахара, которые Кесселю не удалось идентифицировать. Два идентифицированных вещества с молекулами, состоящими из двойных спиралей атомов, Кессель назвал аденином и гуанином (иногда они просто именуются А и Г). Еще их называют пуринами. Кессель также открыл три разновидности пиримидинов (с одиночным кольцом атомов, включая два атома азота), которые называются цитозин, тимин, урацил.

Русский ученый, работавший в Америке, Фабус Арон Теодор Левин (1869 — 1940) продолжил разработки в 1920—1930-х годах. Он показал, что в молекуле нуклеиновой кислоты молекула фосфорной кислоты, молекула сахара и один из пуринов или пиримидинов формируют трехчленный блок, названный им нуклеотидом. Молекула нуклеиновой кислоты состоит из цепочек этих нуклеотидов, как протеины состоят из цепочек аминокислот. Нуклеотидная цепочка составлена из фосфорной кислоты одного из нуклеотидов, присоединенной к сахарной группе другого нуклеотида. Таким образом, строится «сахарофосфатный позвоночник», от которого отходят индивидуальные группы пуринов и пиримидинов.

Далее Левин показал, что молекулы Сахаров, находящиеся в нуклеиновых кислотах, бывают двух типов: рибоза (содержащие только пять атомов углерода вместо шести, как у общеизвестных Сахаров) и деоксирибоза (как рибоза, только в молекуле на один атом меньше кислорода). Каждая молекула нуклеиновой кислоты содержит только один тип Сахаров — но не оба вместе. Таким образом, различаются два типа нуклеиновых кислот: рибоксинуклеиновая кислота (РНК) и деоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Каждая содержит пурины и пиримидины только четырех разновидностей. У ДНК в составе нет урацила и имеется А (аденин), Г (гуанин), С (цитозин) и Т (тимин). У РНК в составе нет тимина, но есть А, Г, У.

Шотландский химик Александер Робертус Тодд (190-7 — 1997) подтвердил сделанные Левиным выводы в 1940-х годах синтезом различных нуклеотидов.

Поначалу биохимики не придали должного значения нуклеиновым кислотам. В каждом отдельном случае открытия ассоциаций протеина с непротеиновыми составляющими протеин считался основной частью молекулы, а непротеиновая составляющая — подчиненной. Нуклеопротеины находили в хромосомах и вирусах, однако считалось само собой разумеющимся, что нуклеино-кислотная часть является подчиненной, а протеин — самостоятельная составляющая,

В 1890-х годах Кессель сделал несколько немаловажных выводов. Клетки спермы почти полностью состоят из плотно упакованных хромосом и несут химическую субстанцию, включающую полный набор «инструкций», по которым родительские характеристики передаются следующему поколению. Однако он обнаружил, что клетки спермы содержат очень простые протеины, гораздо более простые, чем те, что находятся в тканях, в то время как содержимое нулеиновых кислот кажется аналогичным содержимому тканей. Ввиду этого более вероятно, что инструкции по наследованию заключены в неизмененных молекулах нуклеиновых кислот спермы, нежели в упрощенных протеинах, содержащихся в ней. Нуклеиновые молекулы гораздо мельче (состоят всего из четырех нуклеотидов), поэтому им гораздо проще нести генетические инструкции.

Поворотный момент наступил в 1944 г., когда группа ученых под руководством американского бактериолога Освальда Теодора Звери (1877 — 1955) вела исследования со штаммами пневмококков (бактерий, вызывающих пневмонию). Некоторые из штаммов были «гладкими» (вокруг клетки у них наличествовала капсула) — с индексом S, некоторые — «шероховатыми» (без капсулы), им присваивался индекс R.

Далее эксперимент пошел по следующему пути: к штамму без капсул прибавляли экстракт штамма S. Бескаисульные бактерии (R), которые, предположительно, не могли сами ранее вырабатывать капсулу, начинали самостоятельно выполнять эту задачу. Самый ошеломляющий вывод последовал при анализе ориентирующей на изменение физических свойств вытяжки (S): она содержала только нуклеиновые кислоты. Протеин не присутствовал в ней вообще.

В данном случае именно нуклеиновая кислота, а не протеин была генетической субстанцией. С этого момента признано, что нуклеиновая кислота является первоочередным и ключевым веществом жизни.

Начиная с 1944 г., полностью подтвержден новый взгляд на природу нуклеиновых кислот, и ярчайшим подтверждением явилось исследование природы вирусов. Было выявлено, что наружной оболочкой вируса является протеин, а внутренним содержимым — молекула нуклеиновой кислоты. Биохимику Хайнцу Франкел-Конрату удалось расчленить эти две составляющие. При этом оказалось, что протеиновая составляющая абсолютно неинфекционна — она мертва. Нуклеиновая составляющая проявила небольшую инфекционность, однако ей не хватало для проявления своих свойств протеиновой составляющей.

Работа с радиоизотопами показала, что когда бактериофаг внедряется в бактериальную клетку, то проникает сквозь клеточную оболочку лишь нуклеиновая составляющая. Протеиновая составляющая остается снаружи. Внутри клетки нуклеиновая кислота не только привносит выработку все большего количества нуклеиновых молекул, но и протеиновых молекул для формирования оболочки, причем своего характерного протеина, а не протеина бактериальной клетки. В дальнейшем не было сомнений, что именно молекула нуклеиновой кислоты, а не протеина несет генетическую информацию.

Молекулы вирусов содержат либо только ДНК, либо только РНК, либо и то и другое. Внутри клетки ДНК находится только в генах. Поскольку гены — это блоки, несущие наследственность, значение нуклеиновых кислот сводится к значению ДНК.

Структура нуклеиновых кислот

После работы Звери нуклеиновые кислоты начали пристально изучать. Обнаружилось, что они представляют собой огромные молекулы. После того как выяснилось, что предыдущие методы экстракции были слишком грубыми для расщепления молекул на фрагменты, были разработаны более тонкие методики. Они показали, что молекулы нуклеиновых кислот так же велики или даже больше, чем протеиновые молекулы.

Биохимик Эрвин Шаргафф расчленил молекулы нуклеиновых кислот и подверг фрагменты сепарации методом хроматографии. Он доказал, что в молекуле ДНК число пу-риновых групп равно числу пиримидиновых групп. Число же адениновых групп (пурин) обычно равно числу тиминовых групп (пиримидин), в то время как число гуаниновых групп (пурин) равно числу цитозиновых (пиримидин). Графически можно это выразить как А=Т и Г=Ц.

Британский физиолог Морис Хью Фредерик Уилкинс применил методику рентгеновской дифракции к структуре ДНК еще в 1950-х годах, и его коллеги биохимики Фрэнсис Комптон Крик и Джеймс Деви Уот-сон разработали молекулярную структуру, полученную экспериментально Уилкинсом.

Полинг как раз разработал теорию спиральной структуры протеинов, и Крик с Уотсоном взяли ее на вооружение в отношении данных, полученных Уйлкинсом. Однако в данном случае спираль должна была получиться двойная. Ученые предположили, что «остов» спирали составляют двойные сахаро-фосфатные цепочки, закручивающиеся вокруг общей оси и формирующие цилиндрическую молекулу. Пурины и ииримидины направлены внутрь, приближаясь к центру цилиндра. Чтобы сохранить диаметр цилиндра однородным, пурин (крупная составляющая) должен прилегать к пиримидину (малая составляющая). Специфически: А прилегает к Т, а Г прилегает к Ц. Именно таким образом объясняются наблюдения и выводы Шаргаффа.

Более того, в качестве ключевого шага в митозе можно теперь было взять удвоение хромосом (в качестве следствия этого факта — воспроизведение молекул вируса внутри клетки).

Каждая молекула ДНК производит свой собственный репликах: две сахаро-фосфат-ные нити раскручиваются и каждая служит моделью для нового «комплекта». Где бы ни находился аденин на данной нити, молекула тимина избирается из запаса, всегда наличествующего в клетке, и наоборот. Где бы ни находилась молекула гуанина, молекула цитозина избирается в пару ей, и наоборот. Вскоре после этих перестроений там, где была недавно двойная спираль, находятся уже две подобные ей двойные спирали.

Две правозакрученныс вокруг общей оси спиральные полинуклеотидные цепи.

А — аденин; Г — гуанин; Т — тимин; Ц — цитозин;

Ф — фосфатная группа; С — моносахарид

Если молекулы ДНК производили это вдоль линии хромосомы (или вируса), то образуются две идентичные хромосомы (или два вируса). Процесс не всегда, однако, идет гладко. Новая молекула ДНК слегка отличается от своего «предка», являясь мутацией, если в ходе удвоения произошли какие-то изменения. Эту модель представили научному миру Уотсон и Крик в 1953 г.

Генетический код

Но как молекула нуклеиновой кислоты передает информацию о физических характеристиках? Ответ на этот вопрос был получен из работ американских генетиков Джорджа Уэлса Бидла и Эдварда Лари Тейтума. В 1941 г. они начали эксперименты со штаммом плесневого грибка Neurospora crassa, живущего на питательной среде, лишенной аминокислот. Плесень сама вырабатывала свои аминокислоты из простых азотных составляющих.

При обработке грибка рентгеновскими лучами происходили мутации, и некоторые из этих мутантов не могли вырабатывать собственные аминокислоты. Однако эти же аминокислоты нужны были грибку для роста. Ученые задались целью доказать, что неспособность к производству аминокислот объяснялась недостатком специфического энзима, которым обладал немутирующий штамм.

Они сделали заключение, что присутствие данного энзима — характерная функция определенного гена, который контролирует данный энзим. Содержащиеся в сперме и яйцеклетках нуклеиновые кислоты имеют определенный набор энзимов. Природа этих энзимов определяет биохимию клетки; наследственные характеристики определяются, в свою очередь, этой биохимией.

Производство энзимов генами должно выполняться посредниками, поскольку ДНК гена остается внутри ядра, а синтез протеинов происходит вне ядра. С применением электронного микроскопа клетка начала изучаться в новом и более тонком аспекте; было также найдено точное место производства протеинов.

Внутри клеток были отмечены структурированные гранулы, по размерам гораздо мельче митохондрий, которые были названы микросомами. К 1956 г. ученый Джордж Эмиль Палад доказал наличие РНК в составе микросом. Поэтому микросомы были переименованы в рибосомы, и именно в них, как оказалось, и происходил синтез протеинов.

Генетическая информация от хромосом должна достигать рибосом, и это осуществляется «посылкой» РНК. Структура определенной ДНК-молекулы «путешествует» с этими посланниками к рибосоме. Малые молекулы трансфер-РНК, впервые изученные американским биохимиком Малоном Хугландом, прикреплялись к специфическим аминокислотам, затем, неся аминокислоты, прикреплялись к определенным точкам на «РНК-посланниках».

Главная и еще неразрешенная проблема состояла в том, чтобы изучить, каким образом определенная молекула трансфер-РНК прикрепляется к определенной аминокислоте. Простейшим решением было, видимо, представить себе аминокислоту, прикрепляющуюся к пурину или пиримидину нуклеиновой кислоты; причем разные аминокислоты крепились то к пурину, то к пиримидину. В молекуле нуклеиновой кислоты около двадцати разных аминокислот и только четыре пурина и пиримидина. Поэтому становится понятным, что комбинация из но крайней мере трех нуклеотидов должна крепиться к каждой аминокислоте. Существует 64 различных возможных комбинации из трех нуклеотидов.

Эта проблема в 1960-х годов называлась проблемой генетического кода.

Происхождение жизни

Шаги, сделанные в молекулярной биологии в середине XX в., выдвинули механистические позиции в науке. Вся генетика интерпретировалась с точки зрения химии, в соответствии с законами, сближавшими живую и неживую природу. Могло даже показаться, будто и сам процесс обучения и запоминания — не что иное, как синтез и поддержание уровня специфических молекул РНК. (И в самом деле, было показано на опыте, как плоские черви, которым скармливали других плоских червей, уже обученных определенным действиям, начинали выполнять те же задачи: вероятно, неразрушенные молекулы РНК переходили в их тело и давали начало навыкам.)

Однако оставался неразрушенным один виталистский бастион XIX в.: невозможность происхождения спонтанных генераций. Если жизнь никогда не сможет произойти от неживой материи, то, как же начиналась жизнь на Земле? Наиболее логичным в таком случае было бы предположить, что жизнь была занесена неким суперестественным агентом, но если отрицать эту идею — что тогда?

В 1908 г. шведский химик Сванте Август Аррениус рассуждал о происхождении жизни. Он предположил, что начало ей, могло быть положено, когда споры из открытого космоса достигли нашей планеты. Частицы живого дрифтовали с бесконечности пространства, слегка притягиваемые звездами, и сеялись то здесь, то там. Но это рассуждение только давало предположение, а не решало вопроса.

Было необходимым вновь взяться за разрешение задачи происхождения живого от неживого. Да, Пастеру удалось сохранять содержимое колбы стерильным в течение ограниченного времени, но если бы содержимое хранилось в течение миллиона лет? Или, допустим, не просто колба с содержимым оставалась бы в течение миллиона лет, а целый океан подобного раствора? И предположим, условия тогда на нашей планете сильно отличались от тех, что есть сегодня?

Нет причины думать, что основные химические составляющие жизни существенно изменились с тех пор. Таким образом, небольшие количества аминокислот присутствуют в некоторых ископаемых, насчитывающих десятки миллионов лет, и они должны быть идентичны тем, что находятся в живой материи организмов сегодня. Однако химия современного мира должна была быть изменена.

Растущие знания о химии позволили американскому химику Харолду Клейтону Ури предположить, что атмосфера на Земле тогда была восстановительной, богатой водородом, метаном и аммиаком; без наличия свободного кислорода.

В таких условиях в верхних слоях атмосферы не должно было быть озонового слоя (озон — форма кислорода). Этот озоновый слой в настоящее время поглощает большую часть ультрафиолетовой радиации. В восстановительной атмосфере эта энергетическая радиация проникала до уровня моря и привносила в океаническую среду условия для таких химических реакций, которые в настоящее время не происходят. Сложные молекулы формируются медленно, и при условии, что в океане еще не существовало жизни, они начали аккумулироваться. В окончательной стадии образовались большие молекулы нуклеиновых кислот, которые были столь сложны, но устройству, что могли уже служить для репликации (самовоспроизводства). Это и явилось началом живого на Земле.

Через мутации и естественную селекцию накапливалось все больше и больше эффективных для воспроизводства форм нуклеиновых кислот. Они постепенно развивались в клетки, некоторые из которых стали вырабатывать хлорофилл. Фотосинтез (при помощи других процессов, не включающих в себя формы жизни) со временем изменил первичную атмосферу до вида и состава, знакомого нам в настоящее время. Она обогатилась кислородом. При сочетании свободного кислорода в атмосфере и условий жизни на Земле, уже подходящих для жизни, стало невозможным возникновение спонтанных генераций того типа, что описан выше.

До большой степени вероятности это только предположение (хотя и очень тщательно обоснованное предположение), однако в 1953 г. один из последователей Ури, Стенли Ллойд Миллер, провел ставшее впоследствии знаменитым исследование. Он начал с эксперимента со тщательно очищенной и стерилизованной водой и добавил к компонентам «атмосферу», состоящую из водорода, аммиака, метана. Он прогнал эту смесь через тщательно заизолированный от внешней среды аппарат с добавлением искусственно сконструированного «ультрафиолетового облучения». Затем смесь была выдержана в течение недели в изоляции и разделена на компоненты хроматографическим методом. Среди компонентов были обнаружены простые органические вещества, и даже простейшие из аминокислот.

В 1962 г. подобный эксперимент был повторен в Калифорнийском университете, где в атмосферу добавляли этан (двууглеродный газ, подобный метану с одним атомом углерода). Тогда было получено еще большее разнообразие органических компонентов. В 1963 г. был синтезирован один из ключевых высокоэнергетических фосфатов — аденозинтрифосфат.

Но если такое возможно в небольшом аппарате в течение всего недели, то, что могло произойти на Земле в течение миллиарда лет?

Конечно, трудно экстраполировать условия на планете на миллионы лет назад, но можно предположить, что на Луне сейчас такие условия, которые приближаются к земным до возникновения на Земле жизни.

Даже на нашей собственной планете мы можем продолжить изучение первобытных условий, поскольку еще в 1960 г. человечество достигло наибольших подводных глубин, где условия враждебны жизни в целом. Не отметена также возможность установления коммуникации с другой ветвью интеллекта — дельфинами.

Но к чему гадать? Сколь бы велики ни были достижения человеческой мысли, впереди еще более захватывающие, еще более потрясающие открытия. Вероятно, это наиболее удовлетворительная часть научной работы. И кто знает, что еще будет открыто живущими даже ныне поколениями?