4.3. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ЭНТОМОПАТОГЕНОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ

4.3.1. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ Bt НА НАСЕКОМЫХ

Основной вклад в развитие инфекционного процесса при заражении Bt вносит белковый кристаллический S-эндотоксин. Наличие параспорального кристаллического включения в вегетативной клетке ^обнаружил еще в 1915 г. Берлинер, однако серьезные исследования его природы и механизма действия начались со второй половины XX в. При этом основополагающие знания были получены при изучении 8-эндотоксина, патогенного для насекомых отряда чешуекрылых.

Большинство генов 8-эндотоксинов Bt принадлежит плазмидам бактериальной клетки. После первого клонирования генов эндотоксина в клетках Escherichia coli получено большое количество данных по выделению разных генов токсинов Bt, что привело к необходимости их систематизации. Гены, кодирующие кристаллические инсектицидные белки, обозначили как cry (от английского crystall — кристалл), а сами токсины — Cry. Присвоенные генам и белкам буквы и цифры отражают степень сходства аминокислотной последовательности белка, например Cry 1Ав или

Cry ЗСа. Помимо Cry-белков, у подвида Zfrsubsp. israelensis известны Cyt-белки, обладающие гемолитическим действием.

По новой номенклатуре предлагаются следующие определения Cry- и Cyt-белков. Cry — белок кристалла, который оказывает экспериментально доказуемое токсическое влияние на целевой организм, или любой белок, аминокислотная последовательность которого имеет очевидное сходство с известным Cry-белком. Cyt означает белок кристалла Bt, который проявляет гемолитическую активность, или любой белок, проявляющий очевидное сходство по аминокислотной последовательности с известным Cyt-белком.

Рентгеноструктурный анализ Сгу-белков обнаружил наличие трех составляющих их доменов (рис. 23). Домен I представляет пучок из семи альфа-спиралей. Домен II состоит из антипараллель-ных бета-структур, которые заканчиваются выступающими петлями. Домен III представляет собой сэндвич из двух бета-структур.

Значительный интерес представляет вопрос о природе рецепторов, с которыми связывается домен II. Обнаружено, что для не-

скольких видов насекомых рецептором Cry 1Ас служит аминопеп-тидаза N (AI1N) с молекулярной массой (м. м.) 120 кДа, включающая N-ацетилглюкозамин как молекулу непосредственного связывания. Выявлены и другие рецепторы разных токсинов, имеющие м. м., отличную от 120 кДа, а именно рецепторы с м. м. 40, 170 и 210 кДа. Обнаружен также рецептор с м. м. 120 кДа, значительно отличающийся от АШЧ. Им оказался биотинсодержащий белок с биотином как молекулой связывания.

Связывание с рецептором предшествует внедрению токсина в клеточную мембрану. Структура домена I определяет механизм внедрения токсина в мембрану. Предложено две модели этого процесса.

Согласно первой модели «перочинного ножа» спирали альфа-5 и альфа-6 домена I раскрываются, как нож, и внедряются в мембрану с одновременной олигомеризацией нескольких молекул токсина для образования поры.

Согласно второй модели «зонтика» пара спиралей альфа- и альфа-5 внедряются в мембрану, как шпилька, тогда как остальные спирали располагаются по поверхности мембран, как спицы зонтика. Спиральная шпилька формирует пору в мембране.

Токсин, внедрившийся в мембрану эпителиальных клеток кишечника насекомых, становится неуязвимым для протеаз и создает поры или ионные каналы. Это ведет к притоку воды и ионов, набуханию и лизису клетки.

Таким образом, схему действия Cry-токсинов можно представить следующим образом:

• связывание с рецептором клеточных мембран;

• внедрение токсина в мембрану клеток с образованием в ней пор или ионных каналов;

• осмотический дисбаланс и гибель клетки.

При этом функция домена I заключается в увеличении проницаемости клеточных мембран, а домена II — в связывании с рецепторами. Домен III проявляет многофункциональность: защищает токсин от чрезмерного протеолиза, связывается с рецепторами и участвует в образовании ионных каналов.

Механизм действия Cyt-токсинов на насекомых отличается от такового Cry-токсинов. Первоначальное связывание происходит с ненасыщенными фосфолипидами клеточных мембран. Сначала токсин связывается как мономер, затем образует агрегаты, формируя поры в мембране, что приводит к цитолизу.

Большинство штаммов Bt содержит комбинации разных Сгу-токсинов. Эти комбинации, как правило, проявляют синергический эффект. Синергизм может наблюдаться между кристаллами и спорами Bt. Хотя действие кристалла — ключевой момент в проявлении токсичности Bt, иногда необходимо присутствие и спор, и кристаллов.

4.3.2. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ НА НАСЕКОМЫХ

Белок вирусов ядерного полиэдроза, заключающий в себе ви-рионы, в пищеварительном тракте разрушается под действием щелочной среды и протеазы кишечника. Вирионы высвобождаются и начинают воздействовать на мембраны клеток насекомых. На самых ранних этапах инфекционного процесса, примерно через 2 ч после поглощения полиэдров насекомыми, высвобожденные вирионы взаимодействуют с микроворсинками цилиндрических клеток эпителия среднего отдела кишечника. Происходит адсорбция вирионов на мембране микроворсинок. Внешняя мембрана вириона после лектин-углеводного узнавания сливается с мембраной микроворсинок, и вирионы с внутренней оболочкой (нуклео-капсиды) проскальзывают внутрь микроворсинок, а затем проникают в клетки кишечника и других тканей и органов. Из нуклео-капсида высвобождается ДНК, которая затем использует генетический аппарат хозяина для воспроизводства вируса.

Репродукция ВЯП обычно происходит в ядрах клеток тканей экто- и мезодермального происхождения. Полиэдры образуются в ядрах клеток жирового тела, гиподермы, эпителия трахей, гемолимфы. Ранние изменения в тканях происходят на биохимическом уровне. Уже через 3 ч после заражения содержание ДНК в кишечнике гусениц превышает норму в четыре раза, а через 12 ч возвращается к исходному уровню. В жировом теле гусениц всплеск увеличения содержания ДНК происходит через 12 ч после заражения. При заражении ВЯП изменяется и количество продуктов пе-рекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях насекомых. Количество их в кишечнике возрастает примерно вдвое уже через 24 ч, в жировом теле гусениц через 3 сут. Формирование новых полиэдров в ядрах клеток происходит через 2...3 сут. Этому предшествует проникновение через ядерные поры в ядро вирусной ДНК, ее репликация, образование вирионов. При этом вирионы располагаются как частокол из палочек, плотно прилегающих друг к другу. Отдельно формируется полиэдренный белок. В целом этот хроматогенный и белковый материал создает так называемую вироген-ную строму. При созревании вирионы обволакиваются полиэд-ренным белком, происходит окончательная сборка полиэдров. Естественно, что при этом нарушается функциональная деятельность ДНК клетки насекомого-хозяина.

Угнетение передачи информации с матрицы ДНК клетки в рибосомы нарушает синтез ферментов, необходимых для энергетических и биосинтетических процессов в клетке. Инфицированные клетки перестают делиться, их ядра переполняются полиэдрами, клетки гибнут, полиэдры выходят из них.

При кишечном ядерном полиэдрозе в эпителиальных клетках среднего отдела кишечника происходят изменения, специфичес-

кие для бакуловирусной инфекции. Через 24 ч после заражения личинок пилильщиков происходит нарушение структуры ядер клеток, формирование вирогенной стромы. Через 70 ч формируются полноценные полиэдры. Развитие вируса завершается разрывом ядерной оболочки и выходом созревших полиэдров в цитоплазму.

Следует отметить определенное сходство в первых этапах механизма действия бакуловирусов и Bt. Энтомопатогенные вирусы и бактерии попадают в организм насекомого перорально с кормом и в том и в другом случае в щелочной среде (pH > 9), и под действием щелочной протеазы происходит растворение белкового матрикса бакуловирусов или дельта-эндотоксина в кишечнике. Общим этапом воздействия энтомопатогенных вирусов и бактерий на организм насекомого может быть усиление перекисного окисления липидов мембран. Известно, что в процессе гибели клеток, вызванной инфекционными заболеваниями, у позвоночных животных и растений усиливается перекисное окисление липидов мембран. Этот процесс осуществляется и в здоровом организме, но с малой интенсивностью.

Перекисное окисление липидов представляет собой цепную свободно-радикальную реакцию, которая развивается очень быстро. Запускает этот механизм так называемый свободный радикал — осколок молекулы, который чрезвычайно активен. Он сталкивается с другими интактными молекулами, превращая их в осколки-радикалы. Происходит цепная реакция. Зарождению первичного свободного радикала способствуют ряд факторов, в том числе инфекция. Усиление процесса ПОЛ ведет к увеличению количества продуктов этого процесса, в частности диеновых конъюгатов и малонового диальдегида. Под действием энтомопатогенных вирусов и бактерий в кишечнике и жировом теле гусениц количество продуктов ПОЛ увеличивается в 1,5...2 раза. Помимо научного интереса эти данные имеют важное практическое значение для разработки препаративных форм биопрепаратов, содержащих компоненты, усугубляющие патологический процесс.

4.3.3. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ НА НАСЕКОМЫХ

Грибы способны проникать в организм насекомых-хозяев различными путями, что значительно расширяет спектр их действия. Основной путь заражения — проникновение через кожные покровы хозяина. Такой способ свойствен большинству энтомопатогенных грибов. Этот способ позволяет грибам в отличие от патогенов вирусной, бактериальной и другой природы заражать насекомых в непитающиеся фазы развития — яйца, куколки, имаго.

Грибная инфекция может проникать в тело насекомых и через ротовое отверстие (перорально). Таким путем в пищеварительный тракт попадают главным образом споры водных грибов, например Coelomycidium sp., Coelomomyces sp. и др. Споры грибов из отдела Deuteromycota, класса Hyphomycetes также могут проникать в кишечник с пищей и там развиваться. Таким образом насекомые заражаются на стадии личинки, иногда имаго.

Известны и такие пути заражения насекомых грибами, как проникновение патогена через дыхальца и отверстие полового аппарата. Например, меланоз яичников пчелиных маток вызывает гриб Aureobasidium pullalans (De Вагу) Arnaud, споры которого после выхода из пищеварительного тракта проникают в организм хозяина через половое отверстие (Лихотин, 1974).

Заражению микозами насекомых способствуют некоторые элементы их морфологического строения, а также образование у грибов специальных приспособлений. Как известно, подавляющее большинство грибов — паразитические организмы, живущие в растениях и животных за счет готовых органических веществ. Поэтому для проникновения, в частности, через хитиновый покров насекомых грибы образуют аппрессории — вздутия на концах ростковых гиф, служащие для прикрепления к кутикуле и проникновения в хозяина посредством мицелиального ростка. Кроме аппрессорий грибы могут образовывать ризоиды, это обычно деформированные гифы, с помощью которых гриб закрепляется на субстрате либо прикрепляет к нему хозяина после его гибели.

Иногда ризоиды имеют отростки, которые проникают в живую ткань хозяина и в результате осмоса обеспечивают патогена питательными веществами. Такие отростки называют гаусториями, они могут быть нитевидными, булавовидными или членистыми. Гаустории образуются и на других частях мицелия — всюду, где грибница соприкасается с поверхностью хозяина.

В некоторых частях мицелия грибные нити сплетаются в густую массу, мицелий уплотняется, образуются твердые части гриба — стромы или склероции. Строма — масса грибницы, служащая основой для образования половых органов гриба, что хорошо прослеживается на плодовых телах грибов рода Cordyceps. Склероции — обезвоженная и уплотненная форма мицелия, устойчивая к неблагоприятным условиям среды. В виде склероциев гриб сохраняется в жизнеспособном состоянии в течение неблагоприятного для него периода.

Другая стадия гриба, служащая для переживания неблагоприятных условий, — покоящиеся споры (хламидоспоры). Это толстостенные образования, часто с двойной оболочкой, как, например, у энтомофторовых грибов или гриба Sorosporella uvella (Krass.) Ld. Представители других родов могут сохраняться в природе в виде спорангиев — особых клеток, в которых заключены спорангиеспо-

ры (сем. Coelomomycetaceae), псевдосклероциев (грибы родов Beauveria, Metarhizium, Hirsutella). Кроме того, они могут существовать в сапрофитном состоянии (некоторые гифомицеты порядка Moniliales).

Большое значение имеет способность грибов к широкому распространению в природе. Они переносятся воздушными течениями, каплями дождя, насекомыми и другими представителями животного мира. Более того, отдельные виды грибов могут активно разбрасывать споры с помощью специальных механизмов. Например, энтомофторовые грибы отстреливают конидии на расстояния, в 1000 раз превышающие размеры самих конидий.

Еще Э. Штейнхаус (1952) отмечал, что грибы в природе и без помощи человека вызывают гибель многих видов вредных насекомых и действительно представляют эффективный естественный контролирующий фактор. В настоящее время известны многие эпизоотии, вызываемые энтомофторовыми грибами (например, энтомофторозы тлей), грибами из родов Beauveria, Lecanicillium (например, микозы белокрылок, огневок) и др.

На развитие грибных эпизоотий среди насекомых влияют различные факторы, из которых особое значение имеют условия окружающей среды — температура, влажность и свет. Температурные границы роста и развития грибов — 5...35 °С, оптимум —

20...30 °С, но есть и исключения. Влажность может быть лимитирующим фактором в течение двух периодов эпизоотии. Во-первых, большинство грибов нуждается в высокой влажности для прорастания спор и развития болезни. Во-вторых, новые споры образуются на трупах обычно лишь в условиях очень высокой влажности. Однако в одних случаях для заражения достаточно сильной росы, в других — необходим дождь.

Свет влияет на долговечность спор (солнечный свет, особенно его ульрафиолетовый компонент, убивает споры) и споруляцию гриба на хозяине после его гибели. Так, свет необходим для образования спор у Paecilomyces farinosus и Cordyceps militaris, а у некоторых видов энтомофторовых грибов отстреливание конидий, способствующее распространению инфекции, происходит только на свету. Таковы условия, необходимые для развития грибных заболеваний насекомых.

При заражении микозом в организме насекомого происходят глубокие внутренние изменения. На первом этапе (проникновение) споры грибов прилипают к наружному покрову насекомых благодаря своей несмачивающейся маслянистой поверхности. В месте соприкосновения с покровом спора прорастает, и ростковая трубка (гифа) проникает через хитиновую кутикулу в тело насекомого. Этому способствуют ферменты, выделяемые грибом (липазы, протеазы, хитиназы), которые размягчают хитиновый покров и образуют в нем отверстие, через которое гриб и проникает внутрь тела насекомого.

На втором этапе, именуемом паразитической фазой, происходит развитие грибов внутри тела насекомого вплоть до его гибели. Различными путями проникнув в полость тела хозяина, патогенные грибы сравнительно быстро (через 32...48 ч) заполняют ее одноклеточными фрагментами мицелия — гифальными телами, или бластоспорами, похожими на дрожжевые клетки. Гифальные тела свободно плавают в гемолимфе, размножаясь делением и почкованием. Считается, что губительное действие грибов на насекомых в основном заключается в блокировании циркуляции гемолимфы, что ведет к последующему разрушению тканей. Кроме того, к летальному исходу могут приводить и выделяемые грибами токсины.

На третьем этапе развития микозов (сапротрофная фаза) рост и развитие грибов происходит после гибели насекомого. При этом в одних случаях внутри тела хозяина происходит созревание покоящихся, устойчивых спор (обычно при неблагоприятных условиях), в других — гифы гриба после гибели хозяина прорастают наружу и на поверхности тела разрастаются в густой мицелий, из которого образуются спороносные гифы с конидиями или покоящимися спорами. Энтомопатогенные грибы проходят в организме хозяина только один цикл развития: от прорастания спор до образования новых.

4.3.4. МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ХИЩНЫХ ГРИБОВ С НЕМАТОДАМИ

Разными исследователями проведен детальный анализ захвата и последующего проникновения гриба в нематоду (Veenhuis, Nordbring-Hertz, Harder, 1985; 1989; Теплякова, Рябчикова, 1991). Встретившись с нематодами, хищные грибы образуют специальные морфологические структуры — ловушки, служащие для их захвата (липкие гифы, мицелиальную сеть или ловчие кольца).

Липкий слой на клетках ловчей структуры обеспечивает захват нематоды грибом. Проникновение в нематоду осуществляется в тех местах, где ловушки прикрепляются к кутикуле. Выделяемый ловушками «клей» или его компоненты обладают парализующим действием на нематоду. После проникновения гриба через кутикулу нематоды происходит переваривание ее внутренних тканей и использование полученной питательной среды для роста грибного мицелия (Теплякова, Рябчикова, 1991; Tunlid, Jansson, Nordbring-Hertz., 1992).

Основную роль в механизме хищничества грибов рода Arthrobotrys играют токсические соединения сесквитерпеновой природы, растворенные в клейком веществе, выделяемом на поверхность ловушек (Беккер, Раджабова, 1973). В экстрактах мице-

лия нескольких видов грибов этого рода обнаружено такое нема-тицидное вещество, как линолевая кислота. В глубинных культурах A. conoides Drechsler и A. oligospora Fres. число образуемых ими ловушек прямо зависело от концентрации линолевой кислоты (Stadle, Anke, Sterner, 1993).

На молекулярном уровне у A. oligospora Fres. идентифицированы два фактора вирулентности: белок, способный связывать углеводы (лектин AOL) и благодаря этому участвующий в процессе узнавания нематоды, и протеаза, которая обеспечивает проникновение гриба через кутикулу, разрушая ее компоненты (Mankau, 1981; Rosen., Kata, Persson. et al., 1996; Rosen, Bergstrom, Karlsson., Tunlid, 1996). Показано, что лектин AOL принадлежит к новому семейству лектинов, сходных по первичной структуре и способности к связыванию. Оказалось, что эти лектины присутствуют как в паразитических, так и в сапрофитных грибах. Это означает, что AOL участвуют не только в захвате и инфицировании нематод, но и в других, более общих клеточных процессах. Более того, эти лектины связывают те участки сахаров, которые обычны в гликопротеидах животных, но не обнаружены в грибах. По мнению авторов, AOL представляет собой мультифункциональ-ный белок, участвующий в ассимиляции и хранении питательных веществ, узнавании углеводов и образовании внутриклеточного матрикса.

Роль второго фактора вирулентности — протеазы — заключается в облегчении проникновения нематоды через кутикулу и переваривании внутренних тканей. Кутикула нематод состоит из белков, включающих коллаген, подверженных разрушению протеолитическими ферментами. На примере A. oligospora Fres. показано, что нематофаговый гриб продуцирует сериновую протеазу (РП), которая приводит к распаду белков кутикулы нематоды (Ahman, Ek., Rask., Tunlid, 1996).