2. Молекулярные методы изучения изменений ДНК в ядрах

2. Молекулярные методы изучения изменений ДНК в ядрах

В предыдущей главе мы уже говорили о гибридизации молекул ДНК. Этот метод позволяет сравнивать, в частности, ДНК, полученные из разных стадий развития одного вида. Если гибридизация ДНК раннего зародыша и взрослого животного полная, то можно говорить, что потерь ДНК в ходе развития не происходит. Имеющиеся сегодня данные говорят именно об этом. Однако точность гибридизации ДНК — ДНК хотя и велика, но еще недостаточна, чтобы говорить о неизменности отдельных генов. Поэтому пока можно утверждать лишь отсутствие существенных потерь в ДНК, но не отсутствие более мелких изменений в отдельных генах.

Долгое время в дифференцированных клетках шли поиски явления амплификации генов, подобного тому, что происходит в ооцитах с генами рибосомной РНК. Казалось, что амплификация должна быть в терминальных и узкоспециализированных дифференцировках, таких, например, как в клетках шелкоотделительной железы шелкопряда, синтезирующей почти исключительно фиброин шелка, и где должны быть исключительно активны лишь один или несколько генов. Однако оказалось, что как раз в этих клетках амплификации обнаружить не удалось, а преимущественный синтез одного белка достигается иными способами — например, большим временем жизни мРНК, в результате чего они накапливаются в клетке. В последние годы амплификацию, однако, удалось обнаружить в нескольких, пока немногих, случаях.

Особый круг явлений был обнаружен при действии па клетки культуры тканей метотрексата — ингибитора фермента дигидрофолатредуктазы. При этом происходит постепенное, в течение многих клеточных поколений, многократное увеличение числа генов этого фермента, так что его активность в клетках возрастает в сотни и тысячи раз. Этот процесс часто называют амплификацией, хотя в данном случае речь идет не о процессе развития (как в оогенезе), а о процессе клеточной эволюции. Число генов дигидрофолатредуктазы умножается лишь у очень немногих клеток, которые единственно и остаются живыми в среде, содержащей ингибитор, т. е. отбираются. Увеличение количества генов происходит, однако, не в результате обычных мутаций: было показано, что на первых этапах увеличивается число генов фермента во внехромосомных фрагментах ДНК, которые лишь позже (при непрерывном действии отбора) встраиваются в хромосомы, создавая в них большие повторяющиеся участки, содержащие ген фермента. Таким образом, речь все же идет об эволюционных изменениях генома, но в нем участвуют плохо пока изученные механизмы выщепления генов из хромосомы, их размножения и последующего, через ряд поколений клеток, встраивания в геном.

Об изменении генома можно, по-видимому, говорить и при политенизации хромосом (например, у дрозофилы): в некоторых их участках (высоко- и среднеповторяющиеся последовательности, и в том числе рРНК) репликация происходит меньшее число раз и в результате возникают недореплицированные районы хромосом.

Амплификацию генов в процессах развития, безусловно, можно отнести к изменению генетического материала, но необратимой ее назвать нельзя: ведь сама хромосома при этом не изменяется. К тому же амплификация проходит совершенно «безвредно» для клеток зародышевого пути — ооцитов, где ее и обнаружили. Этого нельзя сказать об эволюционной амплификации, так как после встраивания многократно повторенных генов в хромосомы, эти изменения генома являются необратимыми, хотя могут подвергаться обратным эволюционным изменениям. Клетки — носители таких изменений — имеют преимущества только при размножении в среде, содержащей метотрексат. Без него их преимущества, очевидно, утрачиваются.

Некоторые свидетельства в пользу изменений генетического материала в развитии были получены при сравнении репликации в различно дифференцированных клетках человека одним из авторов этой книги. Так, оказалось, что включение разных предшественников (нуклеотидов) в ДНК фибробластов и лимфоцитов происходит неодинаково. При радиоавтографическом исследовании было обнаружено, что в гетерохроматические районы некоторых хромосом в фибробластах включается больше аденина и тимина (АТ-пары), чем в лимфоцитах. Это может означать, что состав ДНК в ходе дифференцировки этих двух типов клеток несколько различается, т. е. изменяется.

В последние годы большое внимание уделяется переносу генетического материала внутри генома и между клетками. Известно, что многие ДНК-содержащие вирусы могут встраиваться в ДНК клеток хозяина, некоторое время размножаться вместе с его хромосомами, а затем вновь выходить из состава хромосом, чтобы через некоторое время встроиться в ДНК других клеток. При этом нередко вирусы захватывают с собой и тем самым переносят часть ДНК хозяина. Сейчас этот механизм генетического переноса рассматривается как один из возможных факторов эволюционного процесса, значение которого пока трудно оценить.

Перенос генетического материала внутри геномов и между ними был обнаружен у бактерий и без участия вирусов. Он осуществляется специальными последовательностями ДНК, которые получили названия «i-элементы» и «транспазоны». В последние годы похожее явление переноса было обнаружено и у эукариот. Так, в ходе развития дрозофилы ген white (белые глаза) может перемещаться и в другие участки генома, и это сказывается на его экспрессии. Происходит это, по-видимому, случайно и редко, а поэтому не может играть роли в развитии. Ho если вероятность таких переносов не очень мала, то это может быть реальным механизмом изменения генома в развитии, делающим соматические ядра не способными начать нормальное развитие заново. Эти явления изучены еще недостаточно, чтобы говорить о них больше.

Наконец, самое, может быть, захватывающее открытие последних лет сделал американский ученый Тонегава. Он обнаружил закономерные изменения структуры ДНК в лимфоцитах, продуцирующих иммуноглобулины. Подробнее проблему иммунитета мы разберем в одной из следующих глав, но здесь можно коснуться лишь явления изменений ДНК, происходящего при дифференцировке лимфоцитов. Гены иммуноглобулинов состоят из трех или даже четырех компонентов, каждый из которых представлен в геноме несколькими вариантами. Один из компонентов — вариабельный представлен в геноме несколькими сотнями генов, другой — соединительный — всего четырьмя или пятью, а третий — константный. Ho и константный компонент гена иммуноглобулина в зависимости от этапа и характера дифференцировки представлен одной из шести — восьми последовательностей. Во время дифференцировки лимфоцита происходит объединение этих компонентов в один составной ген, кодирующий полипептидную цепь молекулы иммуноглобулина. Пока не очень понятно, происходит ли такое объединение за счет переноса вариабельной части к соединительной или скорее за счет делеции — потери большого района ДНК (около 20 000 пар оснований), лежащего между одним из вариабельных компонентов и одним из соединительных. В таком переносе можно различать и закономерное и случайное. Закономерно, что перенос происходит только при дифференцировке лимфоцитов и всегда состоит в сближении определенных элементов. Однако выбор того, какой из вариабельных участков сблизится с одним из соединительных, происходит случайно, и этим создаются необходимые различия генов иммуноглобулинов у разных лимфоцитов. Перенос частей гена друг к другу, очевидно, необратим, и, следовательно, ядро лимфоцита уже не содержит всего набора генов: часть вариабельных генов теряется при переносе.

Может быть, этот перенос, или делеция, и не препятствует тому, чтобы ядро лимфоцита, если его трансплантировать в яйцо, участвовало в дифференцировке различных типов клеток. Ho очевидно, что образование разных лимфоцитов из потомков такого ядра будет затруднено, если вообще возможно. К тому же если механизм такой закономерно возникающей делеции в принципе существует, то он может использоваться не только в случае дифференцировки лимфоцитов.

Для того чтобы выяснить, не происходят ли подобные изменения структуры генома при других диффереицировках, было проведено изучение последовательности нуклеотидов, лежащих вокруг гена. Сравнивались гены глобина, овальбумина и другие в тех клетках, где они активны (эритробласты, клетки яйцевода), и в тех клетках, где они не работают. Если бы изменения структуры генома происходили, порядок нуклеотидов в активных и неактивных клетках отличался бы (так и было сделано открытие Тонегавы). Однако ни для глобина, ни для нескольких других исследованных генов таких отличий найдено не было. Это означает, что случай с генами иммуноглобулинов является совсем не общим правилом, а скорее исключением и, может быть, даже единственным.

Заключая эту главу, можно сказать, что в ходе развития животных (в отличие от растений) в соматических клетках, по-видимому, происходят и случайные и закономерные изменения организации и расположения генетического материала. Изменения эти, вероятно, не очень часты и велики, но они все же могут сказываться на ходе развития. Этим, в частности, могут быть объяснены неудачи в попытках получить нормальное развитие до взрослого организма при трансплантации ядер из дифференцированных взрослых клеток. В случае с иммуноглобулинами эти изменения наступают закономерно, и смысл их очевиден. В других случаях изменения генома могут быть и случайными. Они могут не сказываться на развитии тканей и органов, где каждая отдельная клетка выполняет ограниченную функцию и может быть заменена другой клеткой. Ho эти же изменения, повторенные во всех клетках зародыша (при трансплантации ядер), делают, очевидно, полноценное развитие из ядер дифференцированных клеток редким или даже невозможным. Проблема эта, однако, требует новых, более достоверных данных.