ГМ растения, устойчивые к болезням

ГМ растения, устойчивые к болезням

Современная селекция выступает в качестве синтетической дисциплины, широко использующей достижения генетики, ДНК-технологии, физиологии, биохимии, почвоведения, микробиологии, цитогенетики, экологии и других наук, в том числе и агроэкологического районирования и конструирования агроэкосистем. В этой связи большие перспективы представляет сочетание методов традиционной селекции и трансгеноза при создании сортов с вертикальной устойчивостью, а также многолинейных и синтетических сортов. Связано это с тем, что методы генной инженерии позволяют встраивать   в   растение-реципиент   сразу   несколько   разных генов устойчивости, создавая таким образом «пирамиду генов», обеспечивающую комплексную резистентность сорта.

Задача повышения устойчивости культурных растений к стрессовым температурам, воздушной и почвенной засухе, кислым и засоленным почвам, вредителям и болезням стала особенно острой в России и в Украине в настоящее время, в условиях резкого падения общей культуры земледелия, а также в результате снижения количества используемых минеральных макро- и микроудобрений, мелиорантов (извести, гипса и др.) и пестицидов. Однако главное — резкое обострения фитосанитарной ситуации, стремительное распространение таких патогенов, как септориоз, снежная плесень, антракноз, фузариоз колоса, фомопсис, массовые поражения зерновых клопом-черепашкой, саранчой и т.д. В этой ситуации возможны два пути: поиск и создание доноров генов множественной устойчивости и разработка принципиально новых приемов управления генотипической изменчивостью культивируемых растений, в том числе и генетически модифицированных, т.е. методов создания сортов с большей а геоэкологической направленностью — «адресностью», в том числе с повышенными продуктивными, средообразующими и ресурсовоспроизводящими возможностями. Главным приоритетом селекции становится обеспечение устойчивого роста величины и качества урожая в неблагоприятных и экстремальных по почвенно-климатическим условиям зонах. Для каждого сельскохозяйственного региона, района и даже местности предстоит подобрать сочетание культур — «взаимострахователей» и создать соответствующие сорта или соответствующие гибриды. Особое место должна занимать селекция на скороспелость и слабую фотопериодическую реакцию растений. Эффект может достигаться за счет несовпадения во времени и пространстве «критических» периодов онтогенеза растений с действием лимитирующих факторов внешней среды.

Основной фактор, ограничивающий реализацию потенциальной урожайности растений — их болезни. Для 3-4 тыс. используемых человеком «культурных» растений известно около 30 тыс. видов возбудителей: 25 тыс. грибковых болезней, 600 вызывают черви-нематоды, более 200 — бактерии, более 300 — вирусы, и число их растет. У риса и пшеницы известны более 100 возбудителей болезней, у кукурузы — 60, у ячменя и сорго — по 50. Из-за них еще до сбора урожая теряются 10-15% зерна. Различные паразиты, в том числе насекомые, и сорняки доводят объем предуборочных потерь уже до 25-40%. В мире из-за насекомых теряется 14% урожая, заболеваний растений, вызванных червями и грибами, — 12, сорняков — 9%, и 10% уничтожаются грызунами. Предуборочные потери зерновых составляют более 1800 млн. т. А после уборки в процессе транспортировки и хранения гибнут еще 5-25% урожая в зависимости от страны. И получается, что в развитых странах суммарные потери достигают 40%, в развивающихся, по вполне понятным причинам, они превышают более 50% возможного урожая.

Только в 1980 г., по экспертным оценкам, потери злаковых культур до сбора урожая достигли 277 млн. т, что составило 40 млрд. долл., а стоимость утраченного зерна после сбора урожая превысила еще 20 млрд. долл. За последующие два десятилетия никаких заметных изменений в лучшую сторону не произошло. Из этих потерь в какой-то мере оправданными можно считать те, которые вызваны болезнями растений, так как они способствуют выработке у них иммунитета к другим вредным факторам. К сожалению, даже гипердозы химикатов не помогают справиться с этими болезнями, а лишь способствуют их трансформации в устойчивые формы, а также вызывают хронические интоксикации у людей и животных. Очевидно, что разумнее было бы воздержаться от химической войны с ними, сведя неизбежные потери к минимуму простыми агротехническими приемами.

При атаке патогенов в растениях включается целый набор различных механизмов, результатом работы которых могут быть: полная невосприимчивость к патогену (иммунитет), быстрая программируемая гибель клеток в сайтах атаки патогена (сверхчувствительная реакция) и различные степени поражения вплоть до полной гибели растения.

В обеспечении защиты растений от заболеваний, вызываемых грибами, бактериями и вирусами, участвует ряд ключевых механизмов, модификация которых в настоящее время уже используется для получения устойчивых растений. Перечень таких ключевых этапов защиты растений от заболеваний, индуцируемых патогенными агентами, и примеры их модификаций представлены ниже.

Усиление сигнальных систем, участвующих в формировании иммунного ответа. Растения узнают патоген по сигнальным молекулам — элиситорам. У многих видов растений в ответ на атаку патогенов возникает системно индуцированная устойчивость (SAR), эффект которой может продолжаться неделями и месяцами. Идентифицирован ряд генов SAR. Растения, в которых экспрессировалась ДНК этих генов, характеризовались высоким уровнем толерантности к патогенам. Одной из первых реакций для индукции SAR становится синтез салициловой кислоты.

Одним из самых ранних ответов на атаку патогена является накопление H₂O₂ и других активных форм кислорода. В дополнение к его окислительному потенциалу, проявляющемуся в гибели или ингибировании клеток патогена, в действие Н₂0₂ вовлечен ряд других защитных механизмов. Обнаружен быстрый синтез перекиси водорода при реакции несовместимости не только как локальный пусковой сигнал (триггер) индукции сверхчувствительной гибели клеток, но также как диффузный сигнал для активации генов защиты, например, глютатион-5-трансфераз в окружающих клетках.

Реакция растений на патогены определяется «совместимостью», когда патоген преодолевает механизмы защиты растения и проявляются симптомы поражения, или «несовместимостью», когда механизмы устойчивости исключают или существенно тормозят развитие патогена.

Еще в 1971 г. Флор выдвинул гипотезу, согласно которой реакция «несовместимости» может контролироваться одной парой генов: геном R устойчивости растения и геном Аvr авирулентности патогена.

Эти гены часто объединены в комплексы. Они могут претерпевать рекомбинации, дупликации, делеции и другие перестройки генетического материала хромосом, что приводит к эволюции новых вариантов специфической устойчивости. На проявление устойчивости могут также влиять эффекты дозы генов, неаллельные взаимодействия и эпистаз. Их эффект может также модифицироваться генетическим окружением растения-хозяина. Эти гены-модификаторы не всегда способны сами влиять на реакцию устойчивости, однако, возможно, они образуют систему генов, от кодирующих детерминанты специфического узнавания патогенов, до генов, кодирующих соединения, которые вызывают гибель клеток при несовместимых комбинациях.

В последние годы для получения трансгенных растений, устойчивых к болезням, разрабатывали следующие подходы: синтез значительных количеств антигрибных протеинов, таких как хитиназы и глюканазы, белков, инактивирующих рибосомы, или синтез низкомолекулярных фунгитоксических соединений, таких как фитоалексины и дефензины.

Возможно также получение трансгенных растений, синтезирующих новые фитоалексины или фитоалексины измененной структуры.

Удачно закончились опыты по повышению устойчивости табака к фитофторе Phytophthora parasitica путем встройки гена, кодирующего бетакриптогеин под конститутивным промотором вируса 35S мозаики цветной капусты («сильный» промотор, поэтому его в основном используют при трансгенозе). Трансгенные растения показали повышенную устойчивость к ряду рас данного гриба

В томаты встроены два гена ферментов, катализирующих синтез веществ, повышающих устойчивость к фитофторозу, что привело к повышению на 65% их устойчивости по сравнению с контролем. Другие исследователи трансформировали огурцы геном хитиназы риса, повысившим резистентность к серой плесени.

Управление программируемой гибелью клеток (апоптозом). Апоптоз — контролируемая гибель клеток, которая является одним из защитных механизмов растений, когда в ответ на атаку патогена происходит синтез цитотоксичных соединений в пораженных клетках и локальная гибель клеток — так называемая сверхчувствительность. В процессе развития растений программированная гибель клеток (ПГК) наблюдается при старении органов, созревании плодов, ксилогенезе, старении створок бобов и тд. В клетках, претерпевающих ПГК, отмечается активность протеаз и нуклеаз, деградирующих белки и нуклеиновые кислоты. Эти протеазы включают цистеиновые, металлотиониновые, сериновые протеазы, а также ингибиторы аспарагиновой кислоты.

В настоящее время еще не ясны детали ПГК клеток растений, однако уже показано, что основные этапы ПГК клеток животных и растений одинаковы.

Морфологически это наблюдается в виде сморщивания цитоплазмы, конденсации ядра, образовании везикул мембран. Биохимические изменения включают приток ионов кальция, высвобождение фосфатидилсерина, активацию специфических протеаз, фрагментацию ДНК.

Проникающий в клетку инфекционный агент использует клетки растения-хозяина как субстрат для своего роста, развития и размножения. Одним из путей защиты растений является гибель инфицированных клеток. В то же время, субстратом некоторых грибов являются именно мертвые клетки.

Поэтому предотвращение гибели клеток в некоторых случаях делает невозможным рост и развитие патогена, что препятствует его распространению у растения. В этой связи разрабатываются методы контроля апоптоза.

Разработка приемов управления апоптозом путем использования ДНК-технологий — один из путей повышения иммунитета растений к инфекциям. Это достигается путем введения генов, которые управляют апоптозом.

Приведем несколько примеров таких работ.

Предотвращение гибели клеток в некоторых случаях делает невозможным рост и развитие паразита, чем препятствует его распространению в растении. Гриб Sclerotinia sclerotiorum выделяет токсин, летальный для клеток растений хозяев, и использует вещества мертвых клеток для питания. Растения табака были трансформированы геном нематоды CED-9, который ингибировал апоптоз. Трансгенные растения имели повышенную резистентность к данному возбудителю и останавливали его распространение из точки инокуляции. Данная работа интересна не только тем, что предлагает новую стратегию усиления механизмов защиты растений, но и тем, что демонстрирует общность путей контроля апоптоза у растений и животных (Dickman). Трансгенные томаты, несшие ген бакуловируса р35, ингибирующий апоптоз, также имели усиленную резистентность к возбудителям грибковых и бактериальных инфекций. К подобным выводам пришел Дэвид Гилчрист (Калифорнийский университет), выполняя работу по изучению действия микотоксинов на клетки животных и растений. Он сообщил, что один из токсинов (сфинганин), который вызывает лизис тканей мозга лошадей, также вызывает апоптоз у инфицированных растений. Был также сделан вывод, что грибы создают себе субстрат путем стимулирования апоптоза, поэтому его ингибирование может предотвращать развитие грибной инфекции.

Подход, обратный описанному выше, и заключающийся в стимулировании апоптоза, также может быть использован для защиты растений от инфекций.

Компанией Монсанто разработан способ получения трансгенных растений, устойчивых как к бактериальной, так и грибной инфекции. В картофель вводят грибной ген, кодирующий синтез фермента, окисляющего глюкозу с образованием пероксида водорода. Полученные растения устойчивы и к мягкой гнили, и к фитофторе.

Относительно недавно открыты короткие пептиды, богатые остатками цистеина, обладающие антимикробными свойствами. Они названы дефензинами.

В настоящее время созданы трансгенные растения томатов, картофеля, рапса, моркови, яблони и груши с геном дефензинов редьки. Аналогичная работа проводится по созданию трансгенной капусты и малины.