Гетерогенное оплодотворение теплокровных in vitro

Если прямые попытки получения таких гибридов, как овца ? коза, корова ? буйвол, заяц ? кролик, не приводят к результатам, то это может происходить либо от того, что сперматозоид не достигает яйца или достигает его в поврежденном состоянии, или от того, что оказывается невозможным само гетерогенное оплодотворение, или же от того, что гибридный эмбрион погибает на самых ранних стадиях развития. Преодоление этих препятствий возможно будет конечно лишь тогда, когда для каждой гибридной комбинации будет выяснено, где именно это препятствие лежит. В частности необходимо выяснить, в каких случаях оказывается невозможным или затрудненным сам процесс гетерогенного оплодотворения.

У млекопитающих и птиц с их внутренним оплодотворением выяснение этого вопроса связано с большими трудностями и даже почти невозможно in situ. Отсюда, возникает необходимость разработать такую методику, при которой можно было бы непосредственно наблюдать оплодотворение яйца млекопитающего и птицы in vitro. Разработка этой методики в настоящее время уже началась и идет с серьезными успехами.

Помимо очевидного значения для изучения процесса гетерогенного оплодотворения методика оплодотворения in vitro, имеет и другое неменьшее значение для гибридизации, так как она позволяет получать гибридную зиготу, минуя все те трудности, которые связаны с естественным прохождением сперматозоида до яйца. Однако оплодотворение in vitro получит полное значение только в том случае, если мы разрешим вопрос о дальнейшем выращивании полученной in vitro зиготы. Так как выращивание до взрослого состояния эмбрионов млекопитающих и птиц in vitro пока совершенно невозможно, то нами намечена такая схема использования для гибридизации методики оплодотворения in vitro:

1) изъятие яиц из самки;

2) оплодотворение in vitro изъятых яиц спермой другого вида;

3) имплантация полученной зиготы, обратно в фаллопиевы трубы оперированной или другой самки.

Для судьбы метода решающее значение имеет разрешение третьего пункта схемы. В настоящее время однако Можно считать перспективы этого разрешения вполне благополучными.

Еще в 1890 г. Хипе (Неаре М.) удалось трансплантировать оплодотворенные яйца кроликов ангорской породы в трубы самкам-фландрам. Из трех опытов один дал отличные результаты, и приемная мать, будучи затем покрыта самцом-фландром, дала помет, состоявший как из крольчат-фландров, так и из двух типичных белых ангорских кроликов. Эти замечательные опыты остались если не забытыми, то неповторенными до 1930 г. Пинкус (Pincus, 1930) из трех опытов в одном получил положительный результат — самка принесла помет из трех крольчат на 31-й день. Асдель и Хэммонд поставили 21 опыт трансплантации и получили результат у трех самок, В общей сложности в этих опытах на 27 трансплантаций получено 5 удач, т. е. 18,5 %, Эти результаты приходится признать безусловно чрезвычайно интересными и обнадеживающими, учитывая неразработанность ряда вопросов, связанных, с этой операцией. Таковы например опасность ввести яйца слишком рано в матку, еще не подготовленную к восприятию яйца, опасность температурных и кислородных шоков и пр. Пинкусом было поставлено несколько опытов имплантаций яиц, оплодотворенных in vitro, с отрицательными результатами, но в силу неразработанности этой методики подобная неудача не имеет серьезного значения и требует лишь дальнейшей работы в том же направлении. Техника трансплантации описана в работе Хипе 1897 г.

Таким образом уже сейчас можно считать третье звено указанной выше схемы принципиально разрешенным, и вопрос должен итти лишь о дальнейшем. усовершенствовании гибридагогами техники трансплантации, с применением ее к яйцам, оплодотворенным in vitro, может быть о пересадках яиц одного вида в самок другого, более удобного для: работы вида, применении методики к другим видам млекопитающих и т. д. В свете задач, стоящих перед гибридизацией, разработка этой проблемы приобретает исключительный интерес.

Само оплодотворение яиц млекопитающих, in vitro в настоящее время тоже принципиально разрешено. Впервые опыты подобного рода были поставлены Шенком (Schenk, Вена) и Груздевым (Петербург, 1896), но эти опыты в настоящее время имеют лишь исторический интерес. Шенк производил оплодотворение на нагревательном столике Под микроскопом, а Груздев смешивал яйца и сперму в особой пипетке, после чего они вдувались в трубы самки кролика. Однако правильного дальнейшего развития зигот Груздев не получил, и возможно думать в свете работ Пинкуса, что наблюдавшееся Груздевым неправильное дробление носило партеногенетический характер или касалось одной лишь цитоплазмы.

В новейшее время. опыты оплодотворения яиц кроликов in vitro были поставлены Пинкусом (Pincus, 1930), Ямане (Jamane), Красовской и Диомидовой (1934), Диомидовой и Кузнецовой, и техника его разработана уже на достаточно высоком уровне, будучи заимствованной из техники культур тканей (эксплантации). Объектом этих опытов явились яйца кроликов благодаря тому, что провоцированный характер овуляции у этого животного позволяет более или менее безошибочно определять необходимый момент операции для получения годных для опытов яиц.

Это обстоятельство важно потому, что яйца кролика пригодны для: оплодотворения лишь в течение короткого срока по выходе из яичника. В это время они одеты тонкой белковой оболочкой, которая быстро утолщается по мере продвижения яйца вниз по фаллопиевой трубе; и уже через 18 часов после коитуса яйцо становится недоступным для оплодотворения. Для получения годных к оплодотворению яиц самка покрывается вазэктомированным самцом, который, — не эякулируя в самку семени, провоцирует овуляцию. Овуляция наступает примерно через. 10 часов после коитуса, когда и производится операция, В это время яйца находятся уже в трубе. Труба осторожно вырезается, и яйца вымываются из нее раствором Паннета-Комптона или Рингера тонкой пипеткой, вводимой либо с маточного либо с фимбриального конца в зависимости от ожидаемого по времени местоположения яиц. Капли вытекающего раствора принимаются на стерилизованные слюдинки и просматриваются под микроскопом для отыскания яиц.

Когда яйцо найдено, к промывной капле прибавляются капля спермы, капля куриной или кроличьей плазмы и эмбриональный экстракт. Когда прибавленная плазма образует сгусток, фиксирующий яйцо, культура заделывается по методу висячей капли и сохраняется в термостате при 37°. Все манипуляции, начиная с промывания труб, проводятся стерильно в стерильной комнате (боксе).

Через 40–50 минут после прибавления спермы сперматозоиды проникают в яйцо. Яйца млекопитающих входят в трубу с выделившимся первым направительным тельцем. Второе деление созревания наступает естественно лишь в результате оплодотворения. В культурах in vitro это второе деление созревания наступает через 1–2 часа после прибавления спермы. Часов через 8 наступает первое дробление. Удавалось довести in vitro до третьего деления дробления, до стадии 8 бластомеров, на что требуется до 46 часов, — значительно больше, чем при развитии in situ, при котором стадия 8 бластомеров достигается уже через 24 часа.

Для интересующих нас целей — дальнейшей имплантации зиготы в трубу — достаточно убедиться лишь в наступлении гетерогенного оплодотворения, т. е. продержать яйцо in vitro лишь 1–2 часа. Дальнейшее культивирование может понадобиться лишь для того, чтобы вообще можно, было убедиться в удаче гетерогенного оплодотворения, и для цитологической проверки. Опытами Пинкуса было установлено, что в нынешних условиях культуры in vitro неоплодотворенные яйца с некоторым запозданием, но все же начинают обнаруживать признаки как бы партеногенетического дробления. Хотя деление ядра при этом еще не доказано, но по внешнему виду, принимаемому яйцом, его оказывается почти невозможно отличить от нормально дробящегося яйца. Правда, в большинстве случаев, но не всегда, образующиеся шары дробления оказываются при таком «партеногенезе» неодинаковой величины. Так как не вполне равномерное дробление происходит и при нормальном развитии яиц кролика и тем большей неравномерности возможно ожидать при гетерогенном оплодотворении, — то наступление оплодотворения для каждой гибридной комбинации должно быть проверено на окрашенных и нарезанных препаратах.

Для оплодотворения in vitro, особенно для длительных опытов, сперма должна быть получена стерильно из эпидидимиса или из vas defferens в стерильный капиляр.

Гибридизация млекопитающих in vitro в настоящее время произведена Ямане и Диомидовой и Кузнецовой (1933, неопубл.) и Красовской (1934, неопубл.). Ямане оплодотворял яйца кролика спермой крысы и даже лошади. В обоих опытах получено в надлежащем виде выделение второго полярных телец, что Ямане и считает доказательством произошедшего оплодотворения.

Целью его работы была однако не сама гибридизация, но выяснение того, является ли стимул, вызывающий второе деление созревания, специфическим, видовым, или он может быть привнесен и сперматозоидом другого вида млекопитающего. Цитологического исследования судьбы проникшего сперматозоида и участия его ядра в дальнейшем дроблении Ямане произведено не был».

Диомидова и Кузнецова оплодотворяли яйца кролика спермой морской свинки (другой подотряд грызунов) и наблюдали несколько раз правильное дробление, в отдельных случаях до 8 бластомеров. Цитологического подтверждения наступившего оплодотворения произведено еще тоже не было, но правильность и своевременность стадий дробления делают вероятным, что гетерогенное оплодотворение действительно имело место. Наконец в только что законченных опытах Красовской цитологически показано, что при оплодотворении яиц кролика спермой крысы (другой подотряд!) в 75 % происходит настоящее дробление и образующиеся бластомеры имеют ядра. Происходит также выделение и второго направительного тельца. При оплодотворении спермой морской свинки картина оказывается уже существенно иной, — отшнуровываются лишь участки дейтоплазмы, без участия ядра, и не достаточно еще ясно-, происходит ли действительное оплодотворение. Наконец сперматозоиды собаки повидимому вовсе не проникают в яйцо кролика.

Оплодотворение in vitro является делом очень кропотливым, требующим большой тщательности и большого материала. Тем по менее тот свет, который эти работы проливают, на проблему гетерогенного оплодотворения млекопитающих, с лихвой окупает затраченный труд. Если, как и можно было ожидать (см. выше стр. 134), даже столь гетерогенное оплодотворение, как кролик ? крыса (разные подотряды), протекает легко, то проблема помощи ему оказывается снятой и все внимание гибридизатора при работе с млекопитающими придется сосредоточить на проблеме осеменения, в общем гораздо более легкой и перспективной. Необходимо произвести подобные же исследования с другими видами млекопитающих и с птицами.