Липоплексы Фелгнера

Вирусы, даже соответствующим образом прирученные и измененные, представляю гея для многих исследователей либо слишком ненадежными, либо просто опасными соратники в деле осуществления генно-терапевтических хитростей. Достаточно сказать, что встраивая свою ДНК в ядро клетки-хозяина, они могут случайным братом разрывать важные для функционирования клетки гены. К тому же, практически все вирусы распознает иммунная система пациента. Ясно, что атаки с ее стороны могут свести на нет все предварительные ухищрения молекулярных биологов, тщательно готовивших вирусно-генетическую «пилюлю». Не удивительно поэтому, что некоторые исследователи уже довольно давно пытаются вводить ДНК в клетки без помощи вирусов.

Еще в 50-х годах XX века Джон Холланд в Калифорнийском университете показал, что клетки могут поглощать ДНК, выделенную из вирусов и экспрессировать затем некоторые вирусные белки. Следовательно, такой трюк в принципе возможен. Единственное препятствие к совершенствованию подобной процедуры биологи видели в следующем. Молекула ДНК в растворе несет на себе отрицательный заряд. Внешние мембраны большинства клеток также заряжены отрицательно. Следовательно, по законам электростатики ДНК должна отталкиваться от клеточных мембран. Раз так, то для повышения проходимости ДНК через мембраны к этой макромолекуле надо пристегнуть положительно заряженный довесок. Исследователи так и стали поступать, добавляя к подготовленным для введения фрагментам ДНК положительно заряженные фосфат кальция или органический полимер декстран.

Результаты подобных ухищрений радовали, ДНК бодро лезла в клетки, и норой даже, к радости ученых, самостоятельно встраивалась в хромосомы клеток-мишеней. Таким образом, например, еще на заре разработки первых генно-терапевтических методик в клетки человека был введен ген тимидинкиназы, выделенный из вируса герпеса.

В 70-х годах XX века молекулярные биологи научились встраивать нужные гены в небольшие кольцевые молекулы ДНК, обнаруженные у бактерий — так называемые плазмиды. Эти колечки самой природой были устроены так, что могли очень легко присоединяться к основной нити ДНК бактерий или же внедряться в ДНК хромосом высших организмов. С разработкой плазмидной технологии дело введения нужных генов в культивируемые вне организма клетки высших животных и человека было поставлено на поток. Одним из пионеров применения подобных методик был Поль Берг из Стэнфордского университета. Совместно с Деметриосом Пападопулосом ему удавалось помещать плазмиды в сферические жировые оболочки — так называемые липосомы (греч. lipos — жир, soma — тело). При этом составляющие их липидные молекулы были практически такими же, как и в мембранах клеток. В результате липосомы могли сливаться с мембранами клеток-мишеней, вываливая внутрь свое плазмидное содержимое. Аналогичные методики введения генов в липосомной упаковке разрабатывал и Клод Николау из Гарвардской медицинской школы.

В принципе, ничего особо сложного в такой технологии не было. Дело в том, что липосомы образуются спонтанно в суспензии липидов, что еще в 60-е годы было показано Алеком Бенгхемом, работавшим в то время в Кембридже. Вы сами можете легко в этом убедиться, хорошенько встряхнув наполненную водой бутылку, которой до того было налито растительное масло. Конечно, образовавшиеся в воде капли жира не крошечные липосомы, но принцип их появления тот же. Объяснить этот феномен несложно. Молекулы липидов похожи на змей о двух хвостах — они состоят из несущей заряд головки и двух незаряженных длинных углеродных цепочек. Головки гидрофильны — то есть смачивают водой, а хвосты гидрофобны — отталкивают от себя воду. Именно поэтому в водных растворах молекулы жира образуют капли, стенки которых составлены из двух слоев липидов, обращенных друг к другу гидрофобными хвостами (а куда их еще девать?). Полю Бергу было достаточно поместить в водный раствор липиды, из которых состоят мембраны клеток, добавив нужные отрезки ДНК, затем хорошенько потрясти (не вручную, конечно) получившуюся смесь, и липосомы с ДНК-овой начинкой появлялись сами собой!

У новой методики был только один недостаток — липосомы оказывались слишком маленькими для крупных плазмид. Размер липидных миникапель колеблется от 1/10 до 1/25 микрона, в то время как большие плазмиды достигают в длину двух микрон. Устранить это препятствие решился Филип Фелгнер, работавший в Сан Диего (Калифорния). Он создал модифицированные липиды, несущие на своем гидрофильной головке положительный заряд. В результате полученные молекулы легко взаимодействовали с отрицательно заряженными молекулами ДНК, одевая их в своеобразную липидную шубку. Более того, обволакиваемые жирком ДНК спонтанно соединялись при этом в группы, которые, в конце концов, оказывались внутри мембраноподобной оболочки. В результате возникали образования несколько более сложные, чем липосомы. Фелгнер назвал свое детище липоплексами и, со свойственным американцам практицизмом, наладил коммерческое производство модифицированных липидов.

Дело того стоило, поскольку именно с помощью липоплексов Фелгнера в клетки опухолей человека удалось ввести ген HLA-B7, который кодирует белок, помогающий иммунной системе распознавать раковые клетки с такой меткой и уничтожать их. Подобная процедура была произведена на 60 пациентах со злокачественными меланомами (рак кожи), и в трети случаев происходило уменьшение и даже рассасывание опухолей! Положительные эффекты липоплексных инъекций ДНК с геном HLA-B7 ожидаются также в случае неоперабельных раковых опухолей кишечника, почек и молочных желез. В виде аэрозолей липоплексы с «терапевтической» ДНК можно также вводить непосредственно в легкие в случае врожденных фиброзных заболеваний.

Следующий шаг, который предполагает предпринять Филип Фелгнер и его коллеги, — присоединить к поверхности его любимых липоплексов белки, способные специфически связываться с метками на поверхности определенных клеток. Если такой прием удастся, липоплексы начнут напоминать вирусы, которые поражают только определенные клетки-мишени.