Развитие фитовирусологии

Значение теоретических исследований вирусов растений трудно переоценить. Оно далеко выходит за рамки собственно вирусологии. Изучение вирусов растений способствует разработке таких кардинальных общебиологических проблем, как сущность жизненных, явлений, передача генетической информации и синтез белка.

Вирусы растений состоят, как правило, из РНК и белка. До 1968 г. такое строение считалось отличительной особенностью этой группы вирусов, пока Р. Шепард не обнаружил наличия двухцепочечной ДНК у вируса мозаичной болезни цветной капусты.

Вся история учения о вирусах неразрывно связана с развитием представлений о нуклеиновых кислотах.

Изучение наиболее важных теоретических проблем вирусологии на вирусах растений позволило выяснить ряд принципиально важных фактов. В 1938 г. Ф.С. Боуден и Н.У. Пири обнаружили, что вирус карликовой кустистости томатов кристаллизуется, образуя ромбические додекаэдры. По данным Р. Маркхема и К.М. Смита (1949), вирус желтой мозаики турнепса кристаллизуется в форме октаэдров. В 1966 г. М. Вейнтрауб и X.У. Рагетли провели электронномикроскопические исследования тканей растений, пораженных вирусом желтой мозаики фасоли, и описали различные формы кристаллических агрегатов этого вируса. Тзен Ан Чен, X. Хируми и К. Мараморош в 1969 г. обнаружили в клетках растений с симптомами вируса пестростебельности картофеля сравнительно длинные палочковидные частицы, собранные в кристаллы. Многие ученые (У. Стенли, Э. Вэленс и др.), изучавшие эти строго организованные образования, сложенные из вирусных частиц, считают их живыми кристаллами.

В 1956 г. одновременно в лаборатории Шрамма в Тюбингене (ФРГ) и в лаборатории Френкеля-Конрата в Беркли (США) предварительно очищенный препарат ВТМ был расщеплен действием фенола на белковую часть вирусной частицы и нити нуклеиновой кислоты. В отдельности они не проявляли активности. При их объединении инфекционное свойство нуклеопротеида восстановилось. Френкель-Конрат трактовал это явление как реконструкцию, т. е. разборку и сборку частиц вируса. Было показано также, что свойства штамма вируса определяются исключительно нуклеиновой кислотой (см. главу 23).

Более того, по данным М.П. Гордона и С.X. Смита (1960), некоторые растения заражаются свободной нуклеиновой кислотой ВТМ, а не целой частицей нуклеопротеида. Американские ученые А. Зигель, М. Цейтлин и О.П. Зегал (1962) экспериментально получили варианты ВТМ, которые, репродуцируясь в тканях растений, вообще не образуют белковой оболочки. Другой вариант этого вируса, как показали электронномикроскопические исследования, хотя и синтезирует белковые оболочки, но они оказываются необычной формы, и нуклеиновые кислоты не имеют возможности проникнуть в них и образовывать нуклеопротеид. В. Харихарасубраманиан и А. Зигель (1969) выяснили, что у дефектных вариантов ВТМ частицы белка упаковываются беспорядочно и даже образуют конгломераты. При этом нуклеиновые кислоты этих дефектных вариантов ведут себя, как полноценные вирусы.

В последнее время большое внимание привлекает вопрос неспецифичности вирусных и невирусных нуклеиновых кислот в отношении к различным биологически активным веществам. Вот несколько фактов, число которых неуклонно растет. Так, М. Ниренберг[194] и X. Мэтей (1961) установили, что нуклеиновая кислота ВТМ стимулирует синтетическую реакцию включения аминокислот в пептиды бесклеточных экстрактов кишечной палочки. В 1966 г. Р.Е. Мэтьюз и Ж.Д. Гарди произвели сборку белковой палочковидной части ВТМ с нуклеиновой кислотой сферической части вируса репы. В результате был получен вирус, у которого инфекционное свойство определялось нуклеиновой кислотой вируса репы, а серологические реакции — палочковидной оболочкой ВТМ, собранной из белковых частей (шайбочек). Из шайбочек белковой частицы ВТМ были собраны палочки, характерные для нуклеопротеида ВТМ; внутри оказались шарики нуклеиновой кислоты вируса репы. Еще в 1956 г. была опубликована, но осталась тогда незамеченной работа Р.Г. Харта и Дж. Смита, получивших такие же палочковидные частицы, но только содержащие не вирусную, а дрожжевую кислоту и даже синтетические полимеры рибонуклеопротеидов. Голландские ученые Ж.К. Ван-Равенсвай-Клаазен, А.Б. Ван-Леувен, Г.А. Дуижутса и Л. Бош (1967) поставили следующий опыт: в бесклеточные экстракты кишечной палочки они добавили немного нуклеиновой кислоты вируса мозаики люцерны. Произошла реакция, и из бесклеточных экстрактов бактерий образовался полипептид, весьма сходный с белком частиц вируса мозаики люцерны.

Весьма существенную роль в развитии фитовирусологии сыграла работа Ж.Г. Атертона (1968). Атертон утверждал, что ему удалось получить репродукцию ВТМ в культуре животных клеток. Его работа базировалась на многочисленных серологических и электронномикроскопических исследованиях и многократных испытаниях на специальных растениях-индикаторах, с помощью которых устанавливается концентрация вируса в исследуемом объеме и многие другие тесты. Это сенсационное сообщение по вопросу, имеющему принципиальное значение, требует дальнейшего подтверждения, тем более, что при помощи электронного микроскопа Атертону не удавалось пока обнаружить вирусные частицы ВТМ внутри животных клеток. Репродукция вируса устанавливалась биологическим путем на тест-растениях, а электронномикроскопически — только в экстрактах клеток.

В ходе глубоких теоретических исследований, проводимых в СССР и за рубежом, было обращено внимание на тот факт, что в различных тканях растений вирусы распределены весьма неравномерно. В эпидермисе, например, много вирусов мозаики табака или мозаики картофеля, а в клетках меристемы, в точках роста, их может не быть вовсе. Предпринимались попытки, пользуясь хорошо разработанной техникой культуры ткани растений, вырезать в стерильных условиях кусочек такой меристемной ткани и вырастить из него целое и притом здоровое растение. Такая операция может стать незаменимой, когда какой-либо ценный сорт растения оказывается целиком зараженным вирусом. В настоящее время таким способом в широких масштабах получают безвирусные растения картофеля, гвоздики, яблони, крыжовника, табака.

Большие работы по выращиванию из верхушечной меристемы свободных от вирусов нарциссов, тюльпанов, гиацинтов и лилий проводятся в Исследовательском институте оранжерейных культур в Литтл-Хемптоне (Великобритания). Они особенно важны ввиду того, что луковичные культуры очень сильно поражаются вирусными заболеваниями, и до сих пор не было найдено радикального способа борьбы с ними.

Различные вирусы растений характеризуются различной температурой инактивации. Наиболее устойчивые, например ВТМ, выдерживают нагревание до 92° в течение 10 мин. Многие вирусы теряют инфекционность после 10-минутного нагревания при температуре 60° и ниже. За счет более длительного воздействия удается вылечить черенки растений от ряда вирусных заболеваний и при более низких температурах прогревания.

Вирус хлороза и полосатости сахарного тростника инактивируется при погружении черенков на 30 мин. в воду, нагретую до 50°. Р. Антойн (1965) обработал таким образом более 16 000 т. черенков, пораженных этим вирусом. Затем, предварительно прорастив их в теплицах, он вырастил свободный от вируса сахарный тростник на 1821 га. промышленных плантаций. Термотерапия применяется в борьбе с желтухой персика, при некоторых вирусных заболеваниях земляники, картофеля и других культур в тех случаях, когда удается инактивировать вирус и сохранить живыми клетки растения-хозяина. В недавнее время появились работы М. Холингса (1962), Л. Шислера, Я.В. Зиндена и Е.М. Зигеля (1967) и других по вирусным заболеваниям, снижающим урожай шампиньонов. Прогревание субстрата при 33° сразу после внесения колонии гриба приводило к полному оздоровлению культуры шампиньонов.

Вред, причиняемый вирусами растений, очень значителен. ВТМ распространен по всему земному шару. Кроме табака он поражает томаты, петунию, дельфиниум, яблоню и множество других растений. Вирус этот очень устойчив (в сухих растительных остатках он может, например, сохраняться более 50 лет) и исключительно контагиозен. В Англии только в 1949 г. от вирусного заболевания — желтухи свеклы — было недополучено 1 млн. т. сахара. Во многих странах вырождается от 10 до 50 % картофеля, пораженного вирусами. Чтобы в какой-то мере избежать распространения болезни, семенной картофель выращивают в высокогорных районах на высоте 1500–1800 м. над уровнем моря или на специальных закрытых участках, защищенных от заноса туда инфекции с ветром или крылатыми формами тлей.

Разработка наиболее эффективных противовирусных мероприятий требует знания характерных особенностей различных вирусов растений. Важно также учитывать сходство и различие между вирусами человека и животных, с одной стороны, и вирусами растений — с другой. Ввиду принципиальных различий в химическом составе, плотности, проницаемости и пластичности оболочек клеток растений и животных закономерности проникновения вирусов в организм и их перехода из клетки в клетку у вирусов человека и животных иные, чем у вирусов растений.

Частицы вирусов растений очень малы. Длина палочки вируса мозаики равна 270 ммк, а поперечное сечение — 15 ммк. Чтобы заразить кусочек чувствительной животной ткани, достаточно погрузить ее в жидкость, содержащую вирус животных или человека. Ткани растений инфицировать таким способом не удается, если предварительно не повредить эпидермис. При решении вопроса, каким путем вирус в природных условиях переходит из клетки в клетку, внимание фитовирусологов привлекли плазмодесмы — канальцы диаметром в 20–50 ммк, находящиеся в межклеточных мембранах. По ним из зараженной клетки в соседнюю, очевидно, и проникают вирусные частицы одна за другой или даже парами. Согласно электронномикроскопическим исследованиям, диаметр сферических частиц вируса бронзовости листьев томатов от 80 до 120 ммк, а просвет плазмодесмы в клетках томатов всего 20-100 ммк. Но и для более мелких вирусных частиц, таких, как ВТМ или X-вирус картофеля, прохождение через плазмодесмы затруднительно. Как показывают наблюдения на ультратонких срезах тканей растений, вирусные частицы склонны к агрегации; тогда наступает закупорка канальцев скоплениями вирусных частиц. Возможно, вирус переходит из одной клетки в другую без белковой оболочки. В прямых электронномикроскопических исследованиях М.И. Гольдиным и В.Л. Федотиной (1956) было показано, что даже в пределах однородной ткани распределение частиц ВТМ весьма неравномерно. Очевидно, эта неравномерность связана с трудностями передвижения. Закономерности проникновения вирусных частиц в ткани растения извне, их перемещения из клетки в клетку, из ядра в цитоплазму, из цитоплазмы в ядро, хлоропласты, митохондрии и рибосомы относятся к числу наиболее актуальных вопросов современной фитовирусологии.

Изучение путей распространения вирусов в природе и их передачи от больных растений к здоровым обнаружило, что в ряде случаев (например, при заболеваниях винограда, томатов, смородины, огурцов) основными переносчиками являются нематоды, и заражение осуществляется через почву. Оказалось, что между нематодами и вирусами существуют сложные взаимоотношения. Например, вирусные заболевания винограда передаются строго определенным видом нематоды, в организме которой они сохраняются дольше, чем в почве. Вирус кольцевой пятнистости табака остается активным в организме нематоды Xiphinema americanum более 8 месяцев.

Вирусная болезнь салата (big-vein) продолжала распространяться в условиях, когда все известные пути распространения вируса были исключены. Р. Кампбел (1962) установил, что переносчиками возбудителя являются зооспоры плесневого гриба Olpidium brassicae, в которых вирусные частицы способны сохраняться длительное время. Споры гриба, паразитирующего на салате, зараженном вирусом, распространяются ветром на большое расстояние. Оседая на листьях здоровых растений, они прорастают и вносят таким путем вирусные частицы в клетки салата. Этот же гриб служит переносчиком вирусов некроза табака, карликовости табака и других. Зооспоры О. brassicae, инфицированные вирусом карликовости табака, передавали инфекцию 35 видам растений, относящимся к 13 семействам. На I Международном конгрессе фитопатологов в Лондоне (1968) Р.А. Джонс сделал сообщение о вирусе парши картофеля, передаваемом грибом Spongospora subterrunae.Вирус способен сохраняться в спорах этого гриба более года. Аналогичные соотношения установлены между грибом Tolymyxa graminis и вирусом мозаики пшеницы, а также между многими другими вирусами и грибами.

Как показали многочисленные исследования, низшие грибы служат не только переносчиками вирусных заболеваний, но в ряде случаев и сами поражаются вирусами. По данным Э. Эллиса и У. Клейншмидта (1967), в мицелии гриба Penicillium stoloniferum были обнаружены вирусные частицы диаметром 25–30 ммк. У больных грибов уменьшался объем мицелия, но лизиса не наблюдалось. Интересно, что эти пораженные вирусом грибы стимулировали образование противовирусного белкового вещества — интерферона в клетках животных и в культуре ткани. До сих пор было известно, что интерферон возникает в организме человека или животных в ответ на вирусное заболевание. Исследования Эллиса и Клейншмидта показали, что вирусное заболевание — довольно частое явление у Penicillium stoloniferum, Aspergillus glaucus и других грибов.

Противоречивые результаты были получены при исследовании па полях и в лабораториях вируса некроза табака. Постепенно выяснилось, что в вытяжках клеток растений, пораженных этим вирусом (точнее двумя вирусами), закономерно обнаруживаются частицы двух размеров. В частицах меньших размеров (17 ммк.) умещается всего 1160 нуклеотидов, что недостаточно для их самостоятельного существования, и они способны репродуцироваться лишь при участии другого вируса, более крупных размеров. Такие мелкие вирусы получили название вирусов-сателлитов. К. Мундрей (1963) указывает, что вирус-сателлит содержит недостаточное количество информации для своей репродукции в клетке хозяина, но может репродуцироваться, если к нему добавить другой вирус большего размера. Другими словами, один вирус определяет наследственные свойства другого. Сложные взаимоотношения двух вирусов понемногу выясняются. Установлено, например, что вирус-сателлит не гибнет после 10-минутного прогревания при 90° и сохраняется значительно дольше в растительных остатках почвы, чем обыкновенный вирус некроза табака. Однако до понимания сущности этих взаимоотношений еще далеко.

До сих пор предметом споров остается вопрос о том, в каких участках клетки растения происходит формирование вирусных нуклеиновых кислот — в ядре, цитоплазме, хлоропластах или митохондриях. Решение этого вопроса имеет принципиальное значение для выяснения природы вирусов. Известно, что вирусы нормально репродуцируются в культуре тех растительных тканей (в том числе в тканях корней), клетки которых лишены хлоропластов. Д.Е. Шлегель, С.X. Смит и Г.А. де Цоетен (1967) разделяют распространенную точку зрения, согласно которой в ядре образуется вирусная нуклеиновая кислота, а в цитоплазме происходит синтез белковой оболочки и сборка полной вирусной частицы. К. Исау и P.X. Гил (1969) считают, что эта концепция не вяжется с фактом обнаружения вирусного нуклеопротеида в ядре. Как было показано М.И. Гольдиным (1963), вирусные включения казахского штамма ВТМ появляются в цитоплазме постоянно на 2–3 дня раньше, чем в ядре. Если бы репродукция этого вируса происходила первоначально в ядре, то и включения, представляющие собой агрегаты вирусных частиц, должны были бы образоваться в ядре раньше, чем в цитоплазме. Можно было бы допустить, что вирусные частицы, репродуцируясь в ядре, проникают затем в цитоплазму, где накапливаются в достаточном количестве, и только после насыщения ими цитоплазмы начинают агрегироваться, образуя включения в ядре. Но это допущение противоречит тому факту, что, возникнув в ядре, включения продолжают расти и выступают из него в виде длинных нитей в цитоплазму, где уже имеются цитоплазматические нитевидные включения. P.Е. Мэтьюз (1968) сообщает, что его опыты по действию 2-тиоурацила на репродукцию вируса репы свидетельствуют о том, что синтез вирусной белковой оболочки происходит независимо от синтеза вирусной рибонуклеиновой кислоты, которая только и является инфекционным началом. Что касается места формирования собственно вирусной нуклеиновой кислоты, то по этому вопросу даже в отношении одного и того же вируса имеются прямо противоположные суждения. Следует, однако, отметить, что, обнаружение вирусных частиц в цитоплазме или в ядре еще не означает, что вирусная нуклеиновая кислота образовалась именно в этих частях клетки. Чтобы проследить за процессом формирования вирусной нуклеиновой кислоты, потребуются более совершенные методы исследования.

К вирусным заболеваниям растений долгое время относили группу так называемых «желтух», в которую входят столбур томатов, желтуха астр, карликовость шелковицы, «ведьмины метлы» картофеля и многие другие весьма распространенные заболевания растений. Желтухи передаются от больного растения к здоровому только прививкой, а в природных условиях только с помощью цикадок. Эти заболевания характеризуются своеобразным израстанием цветков, уродством кустов, хлорозом и уменьшением размеров листьев. В СССР столбурное заболевание томатов и других пасленовых было изучено К.С. Суховым и А.М. Вовком (1946). Они выявили переносчика столбура — цикадку Hyalesthes obsoletus. В дальнейшем вирусологи СССР и других стран интенсивно изучали столбурное и другие заболевания типа желтух, не сомневаясь в их вирусной природе. Но в 1967 г. японские ученые Я. Дои, М. Теренака и другие обнаружили при помощи электронного микроскопа во флоэме шелковицы (карликовость), астр (желтуха), картофеля (ведьмина метла) микоплазмоподобные организмы. Вскоре микоплазмоподобные организмы были найдены не только в тканях растений, пораженных различными желтухами, но и в тканях цикадок — переносчиков этих заболеваний. У здоровых растений и цикадок их не обнаруживали. В связи с этим открытием вирусная природа желтух растений была Поставлена под сомнение, и до сих пор вопрос об истинной природе возбудителя этого заболевания остается одной из наиболее важных проблем фитовирусологии.