12. Заключение: элиминация ДНК как механизм защиты генома

Исследования RNAi, в особенности у растений и нематод, привели к гипотезе, что этот путь развился как защитный механизм, позволяющий клеткам контролировать пролиферацию вирусов и транспозонов путем разрушения mRNAs и «нацеливания» формирования гетерохроматина на этих геномных паразитах (Matzke and Birchler, 2005). Как уже упоминалось, перемещающиеся элементы, присутствующие в геноме зародышевой линии инфузорий, элиминируются в ходе развития соматического макронуклеуса, что эффективно сводит на нет их влияние. Сделанное на Tetrahymena наблюдение, что метилирование H3K9 маркирует геномные районы для делеции ДНК в ходе развития, заставляет предполагать, что использование RNAi у инфузорий в основе своей сходно с его ролью в формировании гетерохроматина у других эукариот: инфузории лишь продвинулись на шаг дальше и элиминируют гетерохроматин из своего соматического генома. Тем не менее, одним оригинальным вкладом, полученным в исследованиях на инфузориях, является идея о том, что специфические последовательности, «предназначаемые» RNAi для формирования (элиминации) гетерохроматина в ходе раннего развития, селектируются с помощью глобального сопоставления материнских соматического генома и генома зародышевой линии, начинающегося во время мейоза. Этот механизм эффективно защищал бы от вредоносных влияний транспозиции в зародышевой линии: любой новый транспозон, интегрирующийся в материнскую зародышевую линию, распознавался бы как чужеродный путем сравнения с соматическим геномом в ходе полового воспроизведения, что вело бы к его удалению из транскрибированного соматического генома потомков, ограничивая тем самым его будущее распространение.

У Tetrahymena scnRNAs, которые «нацеливают» элиминацию ДНК, весьма вероятно опосредуют trans-нуклеарные «переговоры» между геномом зародышевого пути и соматическим геномом. Неясно, весь ли микронуклеарный геном производит scnRNAs, но неопубликованные данные, полученные на Paramecium, позволяют предполагать, что по крайней мере большая его часть делает это. Анализы с помощью Норзерн-блоттинга выявили мейоз-специфичные, эндогенные короткие РНК, соответствующие клеточным генам, а также транспозонам и IESs (M.Nowacki et al., неопубликовано). Эти короткие РНК имеют длину ~25 нуклеотидов и четко отличаются от ~23-нуклеотидных siRNAs. По-видимому, они функционально эквивалентны scnRNAs Tetrahymena, потому что инактивация специфических Dicer- подобных генов у Paramecium супрессирует их образование во время мейоза и устраняет элиминацию транспозонов и находящихся под материнским контролем IESs, а также материнское наследование делеций макронуклеарных генов (V.Serrano et al., неопубликовано).

Оригинальная модель сканирования генома предполагала, что scnRNAs сравниваются с перестроенной ДНК в материнском макронуклеусе, инактивируя те из последовательностей, которые соответствуют макро-нуклеарным последовательностям, и отбирая для пула, специфичного для микронуклеуса (рис. 7.10а). Однако несколько линий доказательств заставляют предполагать. что scnRNAs могут сравниваться с происходящими из макронуклеуса транскриптами, а не с самой ДНК. Это освобождало бы от необходимости открывать ДНК-дуплекс по всему геному, чтобы провести испытание на комплементарность. Те из введенных в материнский макронуклеус Tetrahymena IESs, которые интерферируют с делецией ДНК, транскрибируются, допуская такую возможность (Chalker and Yao, 2001; Chalker et al., 2005). Транскрипты, возникающие с какой-то IES в материнском макронуклеусе, защищали бы зиготическую IES от элиминации, как изначально постулировалось для объяснения IES-подавления у Paramecium, путем титрования гомологичных scnRNAs. Данные в пользу цитоплазматического фактора, который может «спасать» делецию гена А в штамме d48, также говорят в пользу существования протективных транскриптов и позволяют также предполагать что в цитоплазме, как и в материнском макронуклеусе, мог бы происходить отбор scnRNAs Наконец, это объясняло бы, каким образом посттранскрипционный сайленсинг данного гена у Paramecium может вызывать его делецию в следующем поколении: если транскрипты из материнского макронуклеуса разрушаются, 23-нуклеотидные siRNAs, гомологичные scnRNAs, смогут свободно «нацеливать» делеции в новом макронуклеусе, несмотря на присутствие этого гена в материнском макронуклеусе.

Один интересный аспект этой модифицированной гипотезы, которую можно назвать моделью сканирования транскриптома, заключается в том, что все взаимодействия типа образования пар могут происходить между молекулами РНК. Если scnRNAs в конечном счете «нацеливают» формирование гетерохроматина путем взаимодействия с вновь возникающими транскриптами в гомологичном локусе, как это предполагается у S. pombe и растений, эти более поздние взаимодействия по типу образования пар не обязательно должны фундаментально отличаться от взаимодействий, происходящих на этапе селекции. scnRNAs могут просто спариваться с любой доступной РНК после того как они покинут мейотический микронуклеус. Спаривание с многочисленными макронуклеарными транскриптами, присутствующими в клетке на ранних этапах развития, эффективно удаляло бы гомологичные scnRNAs из пула путем их секвестрации или разрушения. К тому времени, когда зиготический макронуклеус формируется и начинает транскрипцию своего неперестроенного генома, для спаривания с образующимися транскриптами оставались бы лишь специфические для микронуклеуса scnRNAs. Эти взаимодействия по типу спаривания могут вести к делеции ДНК, потому что они происходят в развивающемся макронуклеусе или потому, что они происходят на правильной стадии развития.

В этой модели распознавание «своего» (макронуклеарных последовательностей) и «не своего» (геномных паразитов в зародышевой линии) достигается простым онтогенетическим переключением, изменяющим исход простых взаимодействий по типу спаривания. Концептуально это похоже на процесс, посредством которого иммунная система позвоночных научается различать «свое» и «не свое». Изначально генерируется огромный репертуар лимфоцитов, экспрессирующих различные антитела, но на ранних этапах развития все те из них, которые узнают имеющиеся антигены (наиболее вероятно, «свои» антигены), элиминируются из будущего пула. Коль скоро эта стадия пройдена, узнавание сходного антигена (который на этот раз, скорее всего, является чужеродным) ведет к клональному росту соответствующих лимфоцитов. Геномная иммунная система инфузорий, использующая RNAi, обнаруживает, таким образом, поразительный параллелизм с клеточной иммунной системой позвоночных животных.

^{Рис. 7.10. Модель сканирования транскриптома для сравнения соматического генома и генома зародышевой линии}

^{(а) Регулирование «по умолчанию». (1) После начала мейоза большинство или даже все макронуклеарные и микронуклеарные геномы транскрибируются: штриховые линии в макронуклеусе представляют неохарактеризованные транскрипты. В микронуклеусе транскрипция является двунаправленной и приводит к образованию scnRNAs (коротких двунитевых молекул) для последовательностей всех типов (клеточных генов, светлорозовые стрелки: транспозонов, оранжевая двойная стрелка; IES, зеленые прямоугольники). Эти scnRNAs экспортируются в материнский макронуклеус, где они могут спариваться с гомологичными соматическими транскриптами. Спаривание может происходить и в цитоплазме. scnRNAs, спаривающиеся с гомологичными транскриптами, секвестрируются или разрушаются, тогда как scnRNAs, специфичные для микронуклеуса, реэкспортируются в развивающийся зиготический макронуклеус, где они спариваются с гомологичными последовательностями (ДНК или только что образовавшимися транскриптами), «нацеливая» таким образом метилирование по НЗК9 на специфичные для микронуклеуса последовательности (транспозоны и IESs). (4) Маркированные последовательности элиминируются, (б) Эффекты постгранскрипционного сайленсинга гена в материнском макронуклеусе. Экспериментальная индукция постгранскрипционного сайленсинга многокопийными трансгенами или dsRNA приводит к образованию двунитевых siRNAs, гомологичных этому гену (показано красным цветом). Эти siRNAs разрушают гомологичные материнские соматические транскрипты, так что гомологичные scnRNAs не будут инактивированы и смогут «нацеливать» делецию данного гена в развивающемся зиготическом макронуклеусе}