4.4. Последовательность событий, приводящих к Х-инактивации; ES-клетки как модельная система

Мышиные ES-клетки оказались бесценной модельной системой для исследования динамики инактивации Х-хромосомы. Повышенные уровни Xist-РНК и то, как она покрывает одну из Х-хромосом, впервые обнаруживаются в большой доле клеток спустя 1–2 дня дифференцировки. Имеются данные о том, что в ап-регуляции Xist играют роль как транскрипционные, так и посттранскрипционные механизмы (Panning et al., 1997; Sheardown et al., 1997; Rougeulle et al., 2004). Однако в недифференцированных женских ES-клетках Xist транскрибируется с обеих Х-хромосом, а в мужских — с единственной X, но продукт транскрипции, РНК, быстро деградирует, и лишь небольшие его количества выявляются по соседству с локусом Xist. Были представлены данные о том. что по мере дифференцировки имеет место стабилизация Xist-PHK на одной из двух Х-хромосом женских клеток (Panning et al., 1997; Sheardown et al., 1997). Механизм, лежащий в основе этого этапа избирательной стабилизации РНК, остается неизвестным, как и его вклад в общее увеличение содержания Xist-РНК и в покрытие ею хромосомы в cis-конфигурации.

Было обнаружено, что ряд этапов Х-инактивации совпадает с началом аккумуляции Xist-PHК в дифференцирующихся ES-клетках XX. В их число входят рекрутирование белков PcG и ассоциированное с этим метилирование H3K27, моноубиквитинирование H2A, деацетилирование H3K9 и утрата метилирования в H3K4 (Heard et al., 2001; Silva et al., 2003; de Napoles et al., 2004; Rougeulle et al., 2004). Глобальное деацетилирование гистонов — относительно позднее событие, происходящее в большинстве клеток на 3—5-й день; поэтому весьма вероятно, что оно участвует в поддержании и (или) стабилизации неактивного состояния, а не в его инициации (Keohane et al., 1996). Такая трактовка предполагает, что паттерны ацетилирования в промоторах отдельных генов, претерпевающих инактивацию, отражают паттерны, определяемые с помощью иммунофлуоресцентного анализа целой хромосомы или крупных доменов. Первоначальные исследования с использованием ChIP, заставляют предполагать, что это действительно так, однако необходимы дальнейшие эксперименты с вовлечением большего числа генов (O’Neill et al., 2003).

Аккумуляция вариантного гистона macroH2A1.2 на Xi происходит в ходе дифференцировки ES-клеток XX гораздо позже (Mermoud et al., 1999). Этот вариантный гистон имеет более 200 дополнительных аминокислотных остатков в своем карбокситерминальном конце и несколько аминокислотных замен по всей молекуле. Интересно, что в соматических клетках экспрессия Xist-PHK требуется для того, чтобы сохранить macroH2A на Xi (Csankovski et al., 1999), но ее недостаточно, чтобы рекрутировать macroH2A на ранних этапах дифференцировки (Mermoud et al., 1999; Wutz et al., 2002).

Избирательное метилирование ДНК на Xi — еще более позднее событие в ES-клетках, Динуклеотиды CpG, о которых известно, что они высокометилированы HaXi во взрослых клетках, не становятся метилированными в женских ES-клетках до гораздо более поздних стадий дифференцировки, 14—21-го дня (Keohane et al., 1996). Это согласуется с результатами в самом развивающемся эмбрионе (Lock et al., 1987) и с идеей, согласно которой метилирование ДНК отвечает за стабилизацию, или фиксацию неактивного состояния, а не участует в инициации и распространении.

Таким образом, возникающая картина — это картина скоординированной и тщательно регулируемой последовательности событий, посредством которых изменения хроматина на Xi помещаются на место по мере развития (суммировано на рис. 17.8). Замечательно, что некоторые из этих изменений, например деацетилирование гистонов и метилирование ДНК, происходят после того, как клетки начали продвигаться по различным дифференцировочным путям. Создается впечатление, что программа, отвечающая за завершение [completion] Х-инактивации, выполняется независимо от других программ клеточной дифференцировки. Важно, однако, отметить, что в некоторых аспектах случайная Х-инактивация может происходить только после того, как дифференцировка началась. Например, включение экспрессии Xist-трансгенов в недифференцированных ES-клетках переключает различные модификации гистонов, ассоциированные с гетерохроматинизацией, а также переход к репликации в поздней S-фазе (Wutz and Jaenisch, 2000), но сколько-нибудь заметное включение macroH2A отсутствует; только после того как индуцирована дифференцировка клеток, macroH2A ко-локализуется с Xist-РНК на хромосоме, содержащей трансген Xist (Rasmussen et al., 2001). Ассоциация macroH2A с хроматином, покрытым Xist, зависит от постоянного присутствия Xist-РНК (Csankovszki et al., 1999), но не требует транскрипционного сайленсинга, поскольку она видна также в хромосомах, покрытых мутантной Xist-РНК, лишенной районов, необходимых для сайленсинга (Wutz et al., 2002). Таким образом, Х-инактивация может рассматриваться как конечный результат серии параллельных процессов, из которых лишь некоторые являются взаимозависимыми.

^{Рис. 17.8. Слои эпигенетического сайленсинга накапливаются на Xi в ходе дифференцировки}

^{Диаграмма показывает, как пять разных эпигенетических изменений, связанных с транскрипционным сайленсингом. размещаются на неактивной Х-хромосоме на разных стадиях развития и дифференцировки как у развивающегося эмбриона, так и в клетках ES в культуре. В некоторых клеточных типах метилирование H3K27 является временным, преходящим, обнаруживаемым лишь на ранних стадиях дифференцировки, но не у зрелых клеток}

Важно подчеркнуть, что конкретные энзиматические комплексы или модификации гистонов могут играть критическую роль на определенных этапах процесса Х-инактивации, но могут становиться менее важными или избыточными позднее, возможно, после того, как более постоянные механизмы сайленсинга, основанные на метилировании ДНК. будут помешены в нужное место. Например, метилирование H3K27, катализируемое PRC2, является существенным для успешной Х-инактивации на ранних этапах онтогенеза, но необязательным в более поздние сроки.

Следует также отметить, что в ходе установления импринтированной Х-инактивации у предимплантационных эмбрионов может иметь место иной порядок событий. В частности, обогащение H3K27me3 не обнаруживается до 16-клеточной стадии, значительно позже начала экспрессии Xist (стадия 24 клеток) (Мак et al., 2004; Okamoto et al., 2004). Это может указывать на потребность в специфических, регулируемых в развитии кофакторов для рекрутирования комплекса PRC2 PcG kXL