3.3. Притяжение белков, связывающихся с метил-CpG

Второй способ репрессии противоположен первому, поскольку он связан с белками, которые притягиваются, а не отталкиваются метил-CpG (рис. 18.5 и табл. 18.2). Этот способ репрессии вначале был обнаружен в экстрактах из клеток млекопитающих, которые были способны поддерживать транскрипцию добавленных генов. Добавление следовых количеств ДНК-матрицы сделало возможной транскрипцию с неметилированных репортерных генов, тогда как метилированные репортеры были репрессированы (Boyes and Bird, 1991). Увеличение количества добавляемой ДНК вызывало транскрипцию метилированных и неметилированных матриц на эквивалентных уровнях, что заставляло предполагать, что лимитирующие количества транскрипционного ингибитора, специфичного к метилированию ДНК, раститровывались [were being titrated out]. В соответствии с этой интерпретацией находящаяся в избытке метилированная неспецифическая конкурентная ДНК [excess methylated nonspecific competitor DNA] снимала репрессию метилированных генов в этих экстрактах. Доказательства непрямого подавления транскрипции также поступили из опытов, в которых метилированная ДНК, введенная в клетки млекопитающих и ооциты лягушки, сделала возможной транскрипцию генов только в начале (Buschhausen et al., 1987; Kass et al., 1997). Сайленсинг происходил несколькими часами позже, заставляя предполагать, что сайленсинг может зависеть от сборки хроматина Для того чтобы обнаружить белки, которые могли бы специфически связываться с метилированными генами и обусловливать наблюдаемую репрессию, были применен метод задержки в электрофорезном геле [bandshift assay] с использованием случайных метилированных последовательностей ДНК в качестве зондов. Комплекс ДНК — белок, специфичный к метилированной ДНК (MeCP1), наблюдали в ряде клеточных типов у млекопитающих (Meehan et al., 1989). Индивидуальный связывающийся с метил-CpG белок, МеСР2, был, однако, первым белком, подлежащим очистке и клонированию. Белки с мотивами связывания с ДНК, родственными мотивам МеСР2, были идентифицированы в результате поисков в базах данных и обозначены как семейство метил-CpG-связывающих доменов, охватывающее МеСР2, MBD1, MBD2, MBD3 и MBD4 (табл. 18.2) (Bird and Wolffe. 1999). Один из этих белков (MBD2) является связывающимся с ДНК компонентом комплекса MeCP1 (см. выше).

^{Рис. 18.5. Белки, связывающиеся с метил-CpG}

^{Пять членов белкового семейства MDB, выравненные по их MBD-доменам (пурпурный цвет). Обозначены и другие домены, в том числе домены репрессии транскрипции (TRD, transcriptional repression domains); домены СХХС, «цинковые пальцы» (предполагается участие некоторых из них в связывании неметилированных CpG); повторы GR с неизвестной функцией; гликозилазный домен с неправильным спариванием оснований T:G, участвующий в репарации дезаминирования 5-метилцитозина. Белок Kaiso не имеет домена MDB, но связывается с метилированной ДНК через «цинковые пальцы» (оранжевый цвет) и обладает доменом РОВ/ВТВ, общим с другими транскрипционными репрессорами}

Из белков MBD три — MBD1, MBD2 и МеСР2 — участвуют, как предположили, в зависимой от метилирования репрессии транскрипции (Bird and Wolffe, 1999). Как было показано, неродственный белок, Kaiso, тоже связывается с метилированной ДНК и осуществляет зависящую от метилирования репрессию в модельных системах (табл. 18.2) (Prokhortchouk et aL, 2001; Yoon et al., 2003). Понимание механизма репрессии пришло вместе с осознанием, что МеСР2 связывается корепрессорным комплексом mSin3a и зависит в своем действии от деацетилирования гистонов (Jones et al., 1998; Nan et al., 1998). Это открытие показало, что метилирование ДНК может «считываться» МеСР2 и служить сигналом к изменению структуры хроматина (рис. 18.6). С тех пор было показано, что каждый из этих четырех связывающихся с метил-CpG белков ассоциирован с отдельным корепрессорным комплексом. Особый интерес представляет MBD1, который связывается с метилтрансферазой лизина гистонов, SETDB1, лишь в ходе репликации ДНК (Sarraf and Stancheva, 2004). Продолжающееся метилирование H3K9 гистонов в последовательностях-«мишенях» хромосомной MBD1 и стабильный сайленсинг ассоциированных генов зависят от периодического рекрутирования этой активности, модифицирующей хроматин.

^{Таблица 18.2. Функции белков, связывающихся с метил-CpG}

Знание сайтов-«мишеней» MBD в геноме является предпосылкой для понимания его биологической роли. Можно было бы ожидать, что они конкурируют друг с другом за доступ к метилированным сайтам в силу их перекрывающейся специфичности нуклеотидной последовательности ДНК. Удивительно, что связывающиеся с MBD сайты в геноме в основном не перекрывались, когда их исследовали, используя клетки первичной клеточной линии человека; это позволяет предполагать, что каждый белок, связвающийся с метил-CpG, становится «мишенью» независимым образом (Klose et al., 2005). Это соответствует появляющимся данным, показывающим, что связывание MBD обнаруживает специфичность к нуклеотидной последовательности ДНК (см. табл. 18.2). Например, МеСР2 обнаруживает сильное предпочтение к сайтам mCpG. которые фланкируются цепочкой ДНК, обогащенной AT (Klose et al., 2005). Более того, MBD1 обладает дополнительным связывающимся с ДНК доменом, специфичным к неметилированным CpG, a Kaiso узнает пару соседних мотивов mCpG (Prokhortchouk et al., 2001). Пока что лишь MBD2, по-видимому, обладает эксклюзивным сродством к mCpG.