1.5. РНК-интерференция направляет сборку «молчащего» хроматина

Феномен RNAi был впервые открыт у Caenorhabditis elegans, где было найдено, что результатом экспрессии dsRNA является утрата экспрессии гомологичного гена. Вскоре стало очевидным, что эта форма RNAi связана с процессом транскрипционного сайленсинга генов (TGS), описанного у растений, и подавлением [quelling] у N. crassa (описывается ниже).

У растений и многоклеточных животных известно, что dsRNA, будучи подвергнута процессингу с помощью машинерии RNAi, дает малые РНК, которые осуществляют модификации ДНК и (или) хроматина на гомологичном хроматине. Наличие у дробянковых дрожжей ортологов основных компонентов пути RNAi, т.е. Argonaute (Ago1), Dicer (Dcrl) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (Rdpl), стимулировало их исследование у этих организмов (Volpe et al., 2002), что привело к значительным успехам в понимании опосредованных RNAi модификаций хроматина и сайленсинга.

Фенотипические последствия утери функции Ago1, Dcr1 или Rdpl сходны с таковыми у мутантов swi6: пониженное содержание H3K9me2 и потеря сайленсинга над внешними повторами центромер (рис. 6.36). Однако у мутантов по RNAi были выявлены перекрывающиеся некодирующие РНК-транскрипты (ncRNA) дискретной величины, происходящие с центромерных внешних повторов. Эти ncRNA гомологичны естественно встречающимся малым РНК, называемым короткими интерферирующими РНК (siRNAs; ~21 н.), которые изолированы и секвенированы у S. pombe (Reinhart and Bartel, 2002; Cam et al., 2005). Эти siRNAs генерируются Dicer (компонентом RNAi) посредством расщепления двунитчатых дериватов гомологичных некодирующих транскриптов длинного центромерного повтора [mediated by cleavage of the double-stranded derivatives of the long centromere repeat homologous noncoding transcripts].

Хромодоменный белок Chp1 также оказывается компонентом машинерии RNAi. Chp1 связывается с хроматином H3K9me2 и необходим для сайленсинга репортерных генов во внешних повторах центромер, но он также требуется и для генерации siRNAs, гомологичных центромерным повторам (Noma et al., 2004), и для нормальных уровней метилирования H3K9 на центромерных повторах (Partridge et al., 2002; Sadai et al., 2004). Роль Chp1 была далее подтверждена идентификацией эффекторного комплекса RITS (RNA-induced transcriptional silencing), который содержит Chp1, Ago1, Tas3 и siRNAs, гомологичные центромерным внешним повторам (Motamedi et al., 2004). Кроме RITS был идентифицирован комплекс, содержащий Rdpl (RDRC — RNA-directed RNA polymerase complex), который содержит предсказанную РНК-геликазу (Hrrl) и предполагаемую поли (А) полимеразу (Cidl2). Эти компоненты, по-видимому, также являются важной составной частью процесса RNAi и сборки интактного «молчащего» хроматина на внешних повторах в центромерах (рис. 6.6) (Motamedi et al., 2004).

Наличие независимого от RNAi (и зависимого от Atfl/Pcrl) механизма сайленсинга, действующего в «молчащем» локусе типа спаривания для поддержки гетерохроматина, было обнаружено путем обработки клеток без RNAi ингибитором HDAC трихостатином А (TSA). Результатом этого явилась полная утрата «молчащего» хроматина из района mat2-mat3, имитирующая эффект делетирования atfl или pcrl у мутантов по RNAi (Hall et al., 2002; Jia et al., 2004). Однако, как отмечалось выше, для формирования «молчащего» хроматина в центромерных внешних повторах Atfl и Perl не требуются (Kim et al., 2004). Кратковременное воздействие TSA также вызывает утрату сайленсинга в центромерах, приводя к гиперацетилированию гистонов, сопряженных с дефектной функцией центромеры (Ekwall et al., 1997). Хотя это индуцированное TSA «эписостояние» является метастабильным, оно может воспроизводиться в нескольких циклах клеточного деления и даже в мейозе Наиболее вероятное объяснение заключается в том, что гетерохроматин трудно установить заново, коль скоро достигается это аномальное гиперацетили-рованное состояние. Эписостояния могут также устанавливаться в нарушенном (compromised) локусе mat2-mat3, и они тоже воспроизводятся в мейозе (Nakayama et al., 2000).