4.2. Гетерохроматиновая структура неактивной Х-хромосомы
Со времени самых ранних светомикроскопических исследований вполне осознавали, что Xi обладает свойствами, общими с гетерохроматином. Подобно конститутивному гетерохроматину, обнаруживаемому в центромерах и вокруг них, Xi остается видимой и, вероятно, конденсированной на протяжении всей интерфазы (в виде тельца Барра), и ее ДНК обычно реплицируется в поздней фазе S. Говорится, что Xi состоит из факультативного гетерохроматина. Однако важно помнить, что ДНК конститутивного гетерохроматина обычно обогащена специфическими, повторяющимися сателлитными последовательностями, которые ответственны, по крайней мере частично, за его характерные свойства. ДНК Х-хромосомы не обнаруживает подобной обогащенности, хотя и демонстрирует более слабые различия в специфических повторяющихся элементах, которые могут играть роль в процессе инактивации (см. раздел 4.5). Кроме того, хотя хроматин Xi часто описывается как «конденсированный», тщательный микроскопический анализ и ЗБ-реконструкция хромосом Ха и Xi, помеченных специфичным к ДНК Х-хромосомы зондом, позволяют предполагать, что различие между ними является в большей мере вопросом формы, чем количества хроматина на единицу объема (Eils et al., 1996).
Дальнейшие параллели между Xi и конститутивным гетерохроматином последовали в результате использования непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии для изучения распределения модификаций и вариантов гистонов по метафазным хромосомам и в интерфазных ядрах. Факультативный гетерохроматин неактивной Х-хромосомы и в клетках человека, и в клетках мыши обеднен ацетилированным гистоном Н4 (Jeppesen and Turner, 1993) и в этом отношении напоминает конститутивный, центрический гетерохроматин. Это явилось первой демонстрацией того, что неактивная Х-хромосома маркирована модификацией гистонов специфического типа. Последующие эксперименты, проведенные в нескольких лабораториях, подтвердили эти наблюдения и показали далее, что ацетилированные изоформы всех четырех коровых гистонов (H2A, H2B, H3 и Н4) обеднены и конститутивным, и факультативным гетерохроматином в интерфазных и метафазных клетках (O’Neill et al., 2003 и помещенные там ссылки). В частности, и центрический гетерохроматин, и Xi обеднены H3, ди- и три-метилированным по К4 (H3K4me2 и H3K4me3). Обычно полагают, что эти последние, как и ацетилирование, являются маркерами транскрипционно активного (или потенциально активного) хроматина.
Ситуация становится сложнее, когда рассматривается появление меток, ассоциированных с транскрипционным сайленсингом, а не изчезновение меток, связанных с транскрипционной активностью. Например, гистоны H3, ди- и триметилированные по К9 (H3K9me2/3), — характерные метки транскрипционно «активных» генов, и с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии нередко можно видеть, что они обогащены центическим гетерохроматином (Lachner et al., 2003). Однако по ряду технических и биологических причин, обогащенность ими Xi выглядела неопределенной. По этой причине, следует подчеркнуть значение специфичности антител для получения надежных результатов иммунофлуоресценции Например, лизины 9 и 27 в H3 оба являются частью тетрапептидного ARKS, и антитела, полученные против одного, могут давать перекрестную реакцию с другим. Такие перекрестные реакции должны быть тщательно исключены, прежде чем полученные результаты можно будет надежно интерпретировать. Кроме того, использованная процедура иммунизации и использованный иммуноген могут влиять на тонкую специфичность антисывороток. Например, антисыворотки к H3K9me3, полученные с поперечносшитыми [cross-linked] пептидами, сильнее связываются с этим модифицированным гистоном, когда он находится в гетерохроматиновом районе, чем когда он в эухроматине (Maison et al., 2002). Антисыворотки, полученные таким образом, являются ценными реагентами ддя исследований по гетерохроматину, но не идеальными ддя количественных сравнений гетерохроматина и эухроматина. Наконец, было отмечено, что усиленное иммунофлуоресцентное окрашивание в интерфазе может быть просто результатом более высокой плотности нуклеосом в гетерохроматине (Perche et al., 2000).
Тщательный анализ распределения модификаций гистонов по Xi в культивируемых клетках человека позволил глубже проникнуть в сложность этой системы (Chadwick and Willard, 2004). Определенные и неперекрывающиеся районы в Xi обогащены H3K9me3 и H3K27me3. Таким образом, в отличие от утраты ацетилирования, обогащенность этими модификациями является региональным, а не общим свойством Xi. Любопытно, что районы, обогащенные H3K27me3, оказываются также обогащенными Xist-РНК и вариантным гистоном макроH2A1.2 (Costanzi and Pehrson, 1998). Каким образом макроH2A1.2 мог бы ассоциироваться с Xi и какова его возможная роль в процессе инактивации — эти вопросы обсуждаются далее, в разделе 4.4. Напротив, те районы Xi, которые обогащены H3K9me3, показывают также повышенные уровни гетерохроматинового белка НР1 (о котором известно, что он связывается с метилированными H3K9) и H4K20me3 (метка, также ассоциированная с конститутивным, центрическим гетерохроматином). Важно отметить, что иммуноокрашивание тельца Барра в интерфазных клетках показало такие же паттерны совместного окрашивания, что заставляет предполагать, что различные домены сохраняются на протяжении всего клеточного цикла.
Рис. 17.7. Модели неслучайной Х-инактивации
Первичной неслучайной X-инактивацией обозначают отклонения в первоначальном выборе Х-хромосомы, которая будет инактивирована. Теоретически это могло бы происходить у гетерозиготных самок, где имеется отклонение в вероятности двух аллелей, связывающихся с блокирующим фактором. При вторичной неслучайной Х-инактивации выбор Х-хромосомы, которая будет инактивирована, является случайным, но события клеточного отбора приводят к прогрессивной утрате клеток, инактивирующих одну из двух Х-хромосом. Например, там, где на одной Х-хромосоме имеется вредная мутация, клетки, инактивирующие другую Х-хромосому, хромосому дикого типа, будут предпочтительно теряться
Возникающая картина — это картина сочетания модификаций гистонов, вариантов гистонов, негистоновых белков и Xist-PHK, взаимодействие которых формирует хроматин с его отличительными свойствами транскрипционного «молчания», репликации в поздней S-фазе, конденсированным внешним обликом и (возможно) ядерной локализацией, которые характерны для Xi. Однако точное функциональное значение отдельных хроматиновых доменов на Xi еще предстоит установить. Важное и беспокоящее наблюдение заключается в том, что частота наблюдаемых доменов широко варьирует от одной клеточной линии человека к другой (Chadwick and Willard, 2004). Это может быть не более, чем подтверждением известной избыточности в системе Х-инактивации (например, как отмечалось ранее, в зрелых клетках сайленсинг поддерживается даже тогда, когда Xist-PHK утрачивается), но это также и предупреждение, что культивируемые клеточные линии, особенно иммортализованные. не всегда являются надежным проводником в том, что происходит в первичных тканях, и уж точно не на ранних стадиях развития.
Модификации гистонов, ассоциированные с эухроматином и факультативным, и конститутивным гетерохроматином, суммированы в табл. 17.1. До сих пор лишь Xi, но не конститутивный гетерохроматин, оказалась обогащенной метилированием H3K27 и убиквитинированием гистона H2A по лизину 119 (H2AK119ub) (Plath et al., 2003; Silva et al., 2003; de Napoles et al., 2004; Smith et al., 2004).
Все модификации, перечисленные в табл. 17.1, ассоциированы с общей, гетерохроматиновой конформацией неактивной Х-хромосомы и были идентифицированы с помощью иммунофлуоресцентного анализа либо метафазных хромосом, либо тельца Барра в интерфазных клетках. Однако локальные изменения в модификациях гистонов могут также играть важную роль на различных этапах процесса Х-инактивации. Такие изменения могут быть идентифицированы с помощью микроскопии высокого разрешения или с помощью иммунопреципитации хроматина (СЫР) для того, чтобы картировать модификации, которые объяснялись в главе 10, внутри или по соседству с критичным районом Xic. Например, в недифференцированных ES-клетках крупный домен, простирающийся более чем на 340 т. п.н. в 5’-направлении от гена Xist, характеризуется гиперметилированием H3K9. Гиперметилирование уменьшается по мере того, как клетки дифференцируются и продолжается Х-инактивация (Heard et al., 2004). В женских ES-клетках тот же общий район хроматина обогащен метилированными H3K27 (Rougeulle et al., 2004), а сайты внутри него обогащены ацетилированными H3 и Н4 (O’Neill et al., 1999). Проводимые в настоящее время исследования должны показать, в какой мере эти локальные модификации гистонов в районе Xic являются ранними каузативными событиями, приводящими в действие процесс Х-инактивации, и в какой степени — событиями, совершающимися «вниз по течению» и являющимися (возможно, существенными) компонентами идущего процесса ремоделинга хроматина.
Таблица 17.1. Модификации гистонов. характерные для конститутивного и факультативного гетерохроматина
Указаны модификации гистонов, которыми обогащен (+) или обеднен (-) конститутивный и факультативный гетерохроматин по сравнению с эухроматином. Символ «означает, что уровень модификации неотличим сколько-нибудь от эухроматина. (me) — метилирование. Относится ко всем способным ацетилироваться лизинам. Обогащение в локальных «горячих пятнах», но не повсюду. Временное обогащение в некоторых клеточных типах.
Конститутивный центрический гетерохроматин обогащен метилированной ДНК, прежде всего 5’-метилцитозином в димерах CpG (глава 18). Это согласуется с его низким уровнем транскрипционной активности Как это, возможно, ни удивительно, уровень метилирования CpG на Xi в целом не является существенно более высоким, чем в остальном геноме. Однако специфические «островки» CpG, ассоциированные с «молчащими» генами, в высокой степени метилированы, и экспериментальные данные позволяют предполагать, что метилирование ДНК играет важную роль в стабилизации неактивного состояния. Так, мыши, у которых отсутствуют ферменты, которые либо метилируют немодифицированные до этого CpG (de novo метилтрансферазы ДНК, Dnmta и Dnmtb), либо поддерживают модификацию прежде модифицированных остатков (поддерживающий энзим, Dnmtl), инициируют и осуществляют случайную Х-инактивацию нормальным образом (Sado et al., 2000, 2004). Однако гены на гипометилированной Xi у этих мутантных мышей реактивируются легче, чем Xi у животных дикого типа с нормальными уровнями метилирования (Sado et al., 2000).