10. Регуляция сайленсинга Х-хромосомы модификаторами гистонов MES

В предыдущем разделе описывалась репрессия посредством формирования гетерохроматина, специфичная для единственной Х-хромосомы у самцов ХО и ограниченная стадией пахитены мейоза благодаря MSUD. Каким образом Х-хромосомы поддерживаются в репрессированном состоянии хроматина на протяжении других стадий развития зародышевой линии и у гермафродитов XX? Генетический скрининг мутантов со стерильностью, обусловленной материнским эффектом (mes — matemal-effect sterile), выявил группу из четырех генов mes, которые участвуют в сайленсинге Х-хромосомы у животных XX, а также, вероятно, и у животных ХО. Совместное применение генетического и молекулярного анализа показало, что кодируемые белки MES влияют на сайленсинг, регулируя часть спектра модификаций гистонов, обнаруживаемого на Х-хромосомах в зародышевых клетках. Их функции существенны для выживания и развития зародышевых клеток.

Три белка MES — MES-2, MES-3 и MES-6 — функционируют вместе в составе комплекса, похожего на Репрессивный Комплекс Polycomb (PRC2 у плодовой мушки и позвоночных (см. Xu et al., 2001; Bender et al., 2004; Keteletal., 2005; глава 11). MES-2 и MES-6 червей — это ортологи двух субъединиц PRC2, E(Z) (Enhancer of zeste) и ESC (Extra sex combs) (табл. 15.1). E(Z) и ESC, во взаимодействии по крайней мере с двумя другими партнерами, катализируют метилирование H3K27 гистона, которое, как упомянуто выше, является репрессивной модификацией гистонов. Аналогично этому, MES-2 и MES-6, в комплексе с новым белком MES-3, опосредуют метилирование H3K27 (рис. 15.8). Домен SET белка MES-2 ответствен за метилтрансферазную (НКМТ) активность в отношении лизинов гистонов, тогда как MES-6 и MES-3 оказываются необходимыми либо для связывания с субстратом, либо для усиления каталитической активности. MES-2, MES-3 и MES-6 ответственны за все выявляемое ди- и триметилирование по H3K27 (H3K27me2 и H3K27me3) в большинстве районов зародышевой линии и у ранних эмбрионов, но еще одна НКМТ катализирует это метилирование в соматических тканях. Важно отметить, что в пределах зародышевой линии содержание полностью репрессивной метки, H3K27me3, в Х-хромосомах повышено (рис. 15.8) (Bender et al., 2004). Одним из последствий уничтожения метилирования H3K27 в зародышевой линии является активация генов на Х-хромосоме; у мутантов mes-2, mes-З или mes-6 Х-хромосомы в зародышевой линии гермафродитов не имеют H3K27me, приобретают метки активного хроматина (например, H3K4me и Н4К12ас) и декорируются транскрипционно активной формой РНК-полимеразы (Fong et al., 2002; Bender et al., 2004). Эти данные позволяют предположить, что комплекс MES-2/3/6 участвует, возможно даже непосредственно, в сайленсинге Х-хромосом в зародышевой линии червей. Действительно, предполагается, что десайленсинг Х-хромосом является причиной дегенерации зародышевой линии, наблюдаемой у гермафродитов мутантов mes. Аналогично участию MES-2 и MES-6 в сайленсинге Х-хромосом зародышевой линии гомологи MES-2 и MES-6 у позвоночных участвуют в инактивации соматической Х-хромосомы у животных XX (главы 11 и 17).

^{Рис. 15.8. Модель, показывающая, каким образом MES-2/3/6 и MES-4 участвуют в сайленсинге Х-хромосомы в зародышевой линии}

^{Комплекс MES-2/3/6 концентрирует метку репрессивного хроматина (H3K27me3) на Х-хромосомах и отталкивает MES-4 от Х-хромосом. MES-4 концентрирует другую метку хроматина (H3K36me2) на аутосомах и, как предполагается, отталкивает неизвестный репрессор (желтый шестиугольник), помогая тем самым сфокусировать действие этого репрессора на Х-хромосомах. Результатом оказывается сайленсинг Х-хромосом в результате совместного действия репрессора «желтый шестиугольник» и катализируемого MES-2/3/6 репрессивного метилирования гистонов}

Каким образом комплекс MES-2/3/6 «нацеливается» на участки ДНК, предназначенные для репрессирования, и как метилирование H3K27 подавляет экспрессию генов? Ответы на эти вопросы мы получаем на Drosophila (глава 11). У мух комплекс E(Z)/ESC рекрутируется связывающимся с ДНК белком РНО к определенным сайтам, называемым элементами ответа Polycomb (PREs — Polycomb Response Elements) (Wang et al., 2004). После того как этот комплекс локально метилирует H3K27, репрессия генов опосредуется, по крайней мере частично, рекрутированием репрессивного комплекса Polycomb 1 (PRC1) к H3K27me (Wang et al., 2004). Удивительно, что геном С. elegans не содержит явных гомологов pho или большинства генов, кодирующих PRC1. Поэтому «нацеливание» комплекса MES-2/3/6 и то, как он достигает репрессии, связано, вероятно, со стратегиями, отличающимися от тех, что используются у Drosophila.

Четвертым белком MES, участвующим в репрессии Х-хромосомы в зародышевой линии, является MES-4. Его распределение является нестандартным для связанных с хромосомой белков и полностью противоположно тому, что можно было бы ожидать. В противоположность другим белкам MES, MES-4 связывается с пятью аутосомами, в виде бэндов, и совершенно отсутствует на большей части длины Х-хромосомы (рис. 15.8) (Fong et al., 2004). MES-4, подобно MES-2, содержит домен SET и тоже обладает активностью НКМТ (Bender et al., 2006). Он отвечает за большую часть выявляемого диметилирования H3K36 (H3K36me2) в зародышевой линии и у ранних эмбрионов. Как позволяет предсказать связь MES-4 с аутосомами, H3K36me2 заметно концентрируется на аутосомах. В соматических тканях и у эмбрионов на поздних стадиях развития за метилирование H3K36 отвечает другая НКМТ. Эта последняя активность оказывается связанной с транскрипционной элонгацией, как и в случае дрожжей. Опосредованное MES-4 метилирование H3K36 на аутосомах не зависит от транскрипции и, вероятно, играет другую, нужную для зародышевой лини, эпигенетическую роль (Bender et al., 2006).

Ключевые нерешенные моменты определяют, каким образом MES-4 «нацеливается» на аутосомы и какую роль он там играет. Интересно, что исключение MES-4 из Х-хромосом требует MES-2, MES-3 и MES-6 (рис. 15.8); в отсутствие любого из этих белков MES MES-4 распространяется на X (Fong et al., 2002). Полагают, что нормальная концентрация MES-4 на аутосомах участвует в сайленсировании генов на X. Одна из моделей заключается в том, что MES-4 и (или) его метальная метка (H3R36me2) отталкивает глобальные репрессоры хроматина (желтые шестиугольники на рис. 15.8) с аутосом и таким образом фокусирует действие репрессоров на Х-хромосомах (Fong et al., 2002). Утрата MES-4 вытитровывала бы эти репрессоры с Х-хромосомы на аутосомные районы, и это приводило бы к десаиленсингу X. Комплекс MES-2/3/6 является логическим кандидатом на роль отталкиваемого MES-4 репрессора Однако распределение метилирования H3K27, катализируемого MES-2/3/6, не изменяется видимым образом у мутантов mes-4. Поэтому продолжаются поиски других репрессоров, которые могут принимать в этом участие. Эта модель действия MES-4 сходна с моделью «приобретения специфичности через предотвращение неоднородности» («gaining specificity by preventing promiscuity»), предложенной для Dot1 Saccharomyces cerevisiae (van Leeuwen and Gottschling, 2002). Полагают, что опосредованное Dot1 метилирование H3K79 по хромосомам отталкивает репрессоры Sir и помогает сфокусировать их действие на теломерах. Утрата Dot1 делает возможным распространение Sirs от теломер и приводит к десайленсингу теломер.

Фенотип mes представляет собой превосходный пример эпигенетического феномена с прямой связью с модификациями гистонов. Мутация, связанная с материнским эффектом, определяется как такая мутация, мутантный фенотип которой не выявляется у гомозиготных мутантов первого поколения, но зато обнаруживается у их потомства. В случае мутантов mes/mes первого поколения присутствие некоторых количеств продукта MES дикого типа, продуцируемых матерью mes/+ и упакованных в ооцит, достаточно для должной экспансии двух примордиальных клеток в более чем тысячу полностью функциональных зародышевых клеток. Однако зародышевые клетки у этих фертильных червей mes/mes не могут продуцировать функциональный продукт MES для своего потомства. В результате у этого потомства примордиальные зародышевые клетки претерпевают незначительную пролиферацию и дегенерируют. Активности НКМТ, кодируемые mes-2 и mes-4, должны устанавливать наследуемое состояние хроматина, которое соответствующим образом поддерживается в многочисленных потомках двух первоначальных примордиальных зародышевых клеток. Современная модель функционирования белка MES (рис. 15.8) сводится к тому, что MES-2, MES-3 и MES-6 действуют в комплексе и концентрируют репрессивную модификацию хроматина (H3K27me) на Х-хромосомах в зародышевой линии и непосредственно участвуют в сайленсинге Х-хромосомы. Их активность отталкивает также MES-4 от X. В результате MES-4 покрывает аутосомы H3K36me и модифицирует их — предполагается, что их активность отталкивает репрессивную активность и помогает сфокусировать ее на X. Полагают, что эта система MES действует эпигенетически в зародышевой линии матери и в ранних эмбрионах и устанавливает домены хроматина, которые должным образом маркированы для последующей экспрессии (аутосомные районы) или сайленсинга (Х-хромосомы) в ходе развития зародышевой линии у личинок (см. рис. 15.6). Утрата этой системы MES ведет к гибели зародышевой линии и стерильности, вероятно благодаря, по крайней мере отчасти, десайленсингу Х-хромосом.