2.4. Динамические изменения в паттернах метилирования ДНК в ходе развития

Паттерны метилирования ДНК обнаруживают видимое общее постоянство при исследовании разных типов соматических клеток, хотя локальные изменения в специфических последовательностях ДНК очевидны. Например, островки CpG на одной Х-хромосоме в большом числе становятся de novo метилированными в ходе эмбрионального процесса инактивации Х-хромосомы у самок плацентарных млекопитающих (Wolf et al., 1984). Этот процесс имеет существенное значение для надежного сайленсинга генов на инактивированной хромосоме (рис. 18.4), потому что дефектные по метилированию ДНК мыши или клетки обнаруживают частую транскрипционную реактивацию генов, сцепленных с Х-хромосомой. В транскрипционную активацию некоторых генов во время дифференцировки также вовлечена запрограммированная утрата метилирования ДНК. Например, ген interleukin-2 утрачивает метилирование CpG в своем промоторном районе по мере того, как этот ген становится экспрессируемым в ходе дифференцировки Т-клеток (Bruniquel and Schwartz, 2003). Это деметилирование оказывается существенным предварительным условием для активации гена и является поэтому ключевой частью программы дифференцировки Т-клеток.

^{Рис. 18.3. Метилтрансферазы ДНК у млекопитающих}

^{Каталитические домены членов семейства Dnmtl, Dnmt2 и Втье3 консервативны (сигнатурные мотивы, I, IV, VI, IX и X, наиболее консервативны во всех нитозиновых метилтрансферазах), но между их аминотерминальными регуляторными доменами сходства мало. (PCNA) взаимодействующий с PCNA домен; (NLS) сигнал ядерной локализации; (RFT) домен, «нацеливающий» на фокусы репликации; (СХХС) богатый цистеином домен, который, как предполагается, связывается с последовательностями ДНК, содержащими динуклеотиды CpG; (ВАН) домен «bromo-adjacent homology», участвующий в белок-белковых взаимодействиях; (PWWP) домен, содержащий высококонсервативный мотив «пролин-триптофан-триптофан-пролин». участвующий в ассоциации с гетерохроматином; (ATRX) родственный ATRX богатый цистеином район, содержащий «цинковый палец» С2-С2 и атипичный домен PHD, участвующий в белок-белковых взаимодействиях}

Картирование метилирования ДНК

Чтобы понять функции метилирования ДНК, необходимо сначала выяснить, где оно происходит в геноме. Для этого существуют несколько методов, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

¦ Поскольку метилирование ограничено в основном последовательностями CpG, для картирования широко использовали расщепление рестрикционными ферментами, распознающими содержащие CpG нуклеотидные последовательности ДНК (Bird and Southern, 1978). Преимущество этого метода заключается в том, что можно протестировать большие участки генома, но он ограничен динуклеотидами CpG, которые обнаруживаются в сайтах рестрикционных ферментов.

^{¦ Надежный метод тестирования всех цитозинов в данном участке включает бисульфитную модификацию однонитевой ДНК (Frommer et al., 1992). Это приводит к дезаминированию немодифицированных цитозинов, но 5-метилцитозин остается защищенным. В результате цитозины, сохраняющиеся после обработки бисульфитом, идентифицируются как метилированные. Благодаря своей высокой разрешающей способности и позитивной идентификации метилированных цитозинов этот метод является предпочтительным для анализа паттернов метилирования ДНК, хотя детальный анализ больших участков занимает много времени.}

^{¦ Несколько методов, базирующихся на ПЦР, которые зависят от предшествующей бисульфитной обработки, были разработаны для того, чтобы ускорить анализ интересующих исследователя районов (см., например, Herman et al., 1996). Эти методы очень удобны, но, фокусируясь на нескольких немногих сайтах CpG, они жертвуют детальной информацией, которая была бы получена при бисульфитном секвенировании.}

^{¦ Недавно для картирования метилирования ДНК были использованы микрочипы (microarrays). Например, ДНК, устойчивая к деградации специфичной к 5-метилцитозину нуклеазой МсгВС, может быть использована как зонд для работы с последовательностями геномной ДНК методом tiled arrays, чтобы получить общую картину уровня метилирования в специфическом участке (Martienssen et al., 2005). Можно также провести иммунопреципитацию зондов для tiled arrays, используя специфичные к 5-метилцитозину антитела, что позволяет получить общую картину уровней метилирования ДНК (Weber et al., 2005).}