2. Ацетилирование и деацетилирование
Дополнительные экспериментальные подходы продолжали поставлять данные о том, что ацетилирование (versus отсутствие ацетилирования) коррелирует с транскрипцией. Районы, транскрипционно активные или готовые к транскрипции, склонны иметь «открытую» конфигурацию хроматина и поэтому доступны для таких ферментов, как ДНКаза и MN-ase, которые при добавлении к изолированным, но интактным ядрам могут переваривать ДНК. В начале 1990-х годов исследователи начали использовать иммунопреципитацию хроматина (ChIP, chromatin immunoprecipitation) — мощный метод для анализа того, какие белки связываются с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК in vivo. Этот метод включает создание поперечных сшивок в белках, связанных с ДНК, с помощью таких проникающих в клетку химических реагентов, как формальдегид, и последующую обработку ультразвуком для разрушения комплексов ДНК:белок до более мелких фрагментов. Интересующие исследователя комплексы ДНК:белок затем подвергаются иммунопреципитации с использованием специфических антител в качестве зонда. Затем поперечные сшивки ликвидируются, чтобы изолировать и идентифицировать нуклеотидные последовательности ДНК, ассоциированные с белком, который связался с антителом; при этом для анализа используется либо радиоактивно меченые ДНК-зонды, либо ПЦР Одна группа использовала этот метод, чтобы исследовать корреляцию между сайтами в ДНК вокруг активных глобиновых генов, которые гиперчувствительны к перевариванию ДНКазой и ассоциируются с ацетилированными гистонами в эритроцитах курицы; корреляция оказалась очень тесной (Hebbes et al., 1994). У S. cerevisiae аналогичные подходы были применены в транскрипционно «молчащих» районах генома, и были показаны очень низкие уровни ацетилирования гистонов (Braunstein et al., 1993). Наоборот, генетическое нарушение сайленсинга коррелировало с увеличенным ацетилированием.
Все эти эксперименты постепенно обнаруживали, что гистоны и, в частности, сайты обратимого ацетилирования играют роль в регуляции генов. Однако первые ферменты ацетилирования и деацетилирования ядерных гистонов не были идентифицированы вплоть до середины 1990-х годов, и они явились наиболее прямым доказательством того, что эти ферменты играют роль в ходе транскрипции. Первая ядерная ацетилтрансфераза гистонов (HAT) была выделена из так называемого макронуклеуса (очень крупного транскрипционно активного ядра в отличие от мейотического микронуклеуса) инфузории Tetrahymena, который характеризуется высокими скоростями транскрипции (Brownell et al., 1996). Ключевым подходом для выявления активности HAT оказался анализ «в геле» («in-gel»): сложная смесь белков из клеточных экстрактов была разделена на пропитанном гистонами SDS-геле, затем пептиды были подвергнуты ренатурации, и белки с активностью фермента HAT метили этот гель путем переноса радиактивно меченного кофактора, ацетилкоэнзима А, на локализованные гистоны. Это делало возможным последующее биохимическое фракционирование и очистку этого полипептида. Идентифицированный энзим HAT был гомологичен ранее изолированному у S. cerevisiae коактиватору, называемому Gcn5, о котором было известно, что он взаимодействует с транскрипционными активаторами. Одновременно первая деацетилаза гистонов (HDAC) была выделена посредством биохимической очистки (Taunton et al., 1996). В этом случае фермент был очищен из клеточных экстрактов с помощью ингибитора, связанного с нерастворимым матриксом, который физически связывался с каталитическим сайтом фермента. Энзим оказался гомологичным ранее выделенному гену, игравшему роль кофактора в репрессии генов. Эти замечательные параллельные открытия первых ферментов, которые, как оказалось, метаболизируют ацетильные группы на гистонах, привели к модели, которая в настоящее время стала парадигмой для ген-специфичных гистоновых PTMs: связанные с ДНК активаторы рекрутируют HATs для того, чтобы ацетилировать нуклеосомные гистоны, тогда как репрессоры рекрутируют YDACs для того, чтобы деацетилировать гистоны. Эти изменения ведут к изменениям нуклеосомы и, соответственно, к ап- или даун-регуляции гена (рис. 10.2).
Было показано, что многие другие хорошо известные коактиваторы и корепрессоры обладают активностью HAT или HDAC или ассоциируются с такими энзимами (Sterner and Berger, 2000; Roth et al., 2001). Более того, ферментативные активности HATs и HDACs являются критическими для их роли в активации и репрессии генов. Эти энзимы часто являются компонентами крупных комплексов, модулярных по структуре и функции; модифицирующая гистоны ферментативная активность — это только одна функция, и в числе других, например, рекрутирование связывающегося с ТАТА белка (TBR TATA-binding protein) (Grant et al., 1998). Интересно, что некоторые ядерные рецепторы гормонов функционируют и как связывающиеся с ДНК репрессоры транскрипции (когда они не связаны с гормонами-лигандами), и как активаторы транскрипции (когда связаны с гормонами-лигандами); эти рецепторы осуществляют эти функции отчасти через посредство РТМ хроматиновых участков-мишеней, рекрутируя HDACs, когда они не связаны с лигандами, и HATs, когда связаны (Baek and Rosenfeld, 2004).
Рис. 10.2. Энзимы, модифицирующие гистоны, рекрутируются к промоторам связывающимися с ДНК транскрипционными факторами
Ацетилтрансферазы гистонов (HAT) рекрутируются активаторами, которые связываются с активирующими нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (UAS, upstream activating sequences). Этот фермент катализирует ацетилирование локальных гистонов, которые, как известно, вносят вклад в активацию транскрипции. Деацетилазы гистонов (HDAC) рекрутируются репрессорами транскрипции, которые связываются с репрессивными нуклеотидными последовательностями «вверх по течению» (URS) и деацетилируют локальные гистоны Это вносит вклад в репрессию транскрипции
Белки HAT могут ацетилировать остатки лизина на всех четырех коровых гистонах, но разные энзимы обладают разной специфичностью в отношении предпочтительного субстрата (рис. 10.3; табл. 10.1), хотя каждый энзим редко «нацелен» только на один сайт. Одно главное семейство HAT — GNAT (сокращение для Gcn5 related acetyltransferase) «нацелено» на гистон H3 как на свой основной субстрат. Второе главное семейство, семейство MYST, в качестве своего основного субстрата«нацелено» на гистон Н4. Третье главное семейство — СВР/р300 — «нацелено» и на H3, и на Н4 и является самым неразборчивым. Был выполнен структурный анализ для каталитических доменов первых двух главных семейств (GNAT и MYST), и они оказались различающимися; структура семейства СВР/р300 пока еще не раскрыта. Между прочим, каждое из этих семейств ацетилтрансфераз способно также ацетилировать негистоновые субстраты (Glozak et al., 2005).
Как обсуждалось выше, существуют три модели, описывающие роль HPTMs в регулирование структуры хроматина (рис. 10.1). Первая модель рассматривает структурные изменения в хроматине, индуцируемые прямыми влияниями HPTMs, такие как изменения заряда. В этом случае нейтрализация ацетилированием положительно заряженного лизина уменьшает силу связывания сильно основных гистонов или гистоновых «хвостов» с отрицательно заряженной ДНК и таким образом открывает сайты связывания с ДНК (Vettese-Dadey et al., 1996). Имеются также данные, все еще в пользу первой модели, что ацетилирование может декомпактизировать нуклеосомные порядки, что согласуется с ролью в открывании хроматина для активации генов (Shorgen-Knaak et al., 2006). Третья модель предполагает, что HPTMs обеспечивают поверхность связывания, чтобы белки ассоциировались с хроматином и регулировали ДНК-матричные процессы; впервые это было показано для ацетилирования. Специализированный белковый домен, названный бромодоменом и обычно обнаруживаемый в ассоциированных с хроматином белках, специфически связывается с ацетилированными лизинами (рис. 10.3) (Dhalluinet al., 1999). Бромодомены присутствуют во многих HATs, таких как Gcn5 и СВР/рЗОО. Белки с этим мотивом, когда они являются частью крупных комплексов, ассоциированных с хроматином или изменяющих его, — например, таких как зависимый от АТФ ремоделирующий комплекс, Swi/ Snf — стимулируют его связывание с хроматином (Hassan et al., 2002). Другими примерами белков, которые содержат бромодомены, обладающие специфичностью связывания с ацетилированными гистонами, являются Tafl и Bdfl в комплексе TFIID, Rsc4 в ремоделирующем комплексе Rsc и Brd2 в большом семействе бромодоменных белков.
Рис. 10.3. Охарактеризованные сайты ацетилирования гистонов
Гистоны ацетилируются главным образом по лизиновым остаткам, локализованным в аминоконцах H3 и Н4, за исключением H3K56, локализованного в глобулярном домене. Показаны белки, проявляющие специфичность связывания с ацетилированными гистонами
Существуют многочисленные ферменты HDAC, удаляющие ацетильные группы (Kurdistani and Grunstein, 2003; Yang and Seto, 2003). Они распадаются на три каталитические группы, консервативные в эволюции от S. cerevisiae до млекопитающих, которые обозначаются как энзимы типа I, типа II и типа III, или родственные Sir2. Ферменты типа I и типа II обладают близким механизмом деацетилирования, который не связан с кофактором, тогда как ферменты, родственные Sir2, требуют кофактор NAD в качестве компонента их каталитического механизма. Структура представителей всех этих трех семейств выяснена. Многие HDACs обнаруживаются в крупных мультисубъединичных комплексах, компоненты которых служат для «нацеливания» этих энзимов на гены, что ведет к репрессии транскрипции. Например, Rpd3 является частью крупного комплекса, включающего HDAC Sin3, которая взаимодействует с репрессорами, связанными с ДНК (Kurdistani and Grunstein, 2003; Yang and Seto, 2003). Rpd3 является также частью малого комплекса, «нацеленного» на открытые «рамки считывания» генов (ORFs) через ассоциацию хромодомена с H3KЗбше (дальнейшее обсуждение хромодоменов см. в разделе 4). Результатом этого оказывается деацетилирование гистонов, частично подавляющее инициацию внутренней РНК-полимеразы II (pol II), а также регулирующее различные этапы цикла транскрипции (Carrozza et al., 2005; Joshi and Struhl, 2005).