11. Взаимодействие теломер in trans и перинуклеарное прикрепление гетерохроматина

Одной из наиболее консервативных черт гетерохроматина является его локализация в дискретных ядерных субкомпартментах. Это верно и для почкующихся дрожжей, у которых теломеры во время интерфазы образуют кластеры и остаются тесно ассоциированными с ядерной периферией. Такие кластеры были впервые обнаружены методом иммунно-окрашивания как фокусы локализации белков Rap1 и SIR на фоне их диффузного распределения по всему ядру (рис. 4.9). Подавление сайленсинга мутациями по остатку H4K16 или нарушениями в активности белков Rap1 и yKu сопровождается диспергированием белков SIR из этих кластеров (Hecht et al., 1995; Laroche et al., 1998). Позже было показано, что с ядерной оболочкой связаны не только теломеры, но и локусы HML и HMR Эта связь осуществляется несколькими дублирующими друг друга механизмами, зависящими либо от ассоциированного с тедомерой фактора yKu, либо от формирования «молчащего» хроматина как такового (Hediger et al., 2002). В «молчащем» хроматине функция прикрепления к ядерной оболочке приписывается субдомену белка Sir4, который связывается с белком ядерной оболочки Esc1 (enhances silent chromatin 1; Taddei et al., 2004). Взаимодействия Sir4-Esc1 прикрепляют SIR-репрессированные домены хроматина к участкам ядерной оболочки, отличным от ядерных пор. Даже в отсутствии прикрепления с помощью yKu-механизма ассоциация теломер с ядерной мембраной может поддерживаться посредством комплекса Sir4-Esc1 до тех пор, пока сохраняется сама репрессия. Более того, участки репрессированного хроматина, отделившиеся от теломер в результате рекомбинации, сохраняют SIR-зависимую ассоциацию с ядерной оболочкой (Gartenberg et al., 2004).

^{Рис. 4.8. Организация природных теломер и характер их сайленсинга}

^{Показаны субтеломерные элементы и содержащиеся в них сайты связывания белков. Теломеры деляться на два основных класса: с Х-содержащими и Х+Y’-содержащими концами. Элементы STAR и STR подавляют распространение репрессии и оставляют область сниженной репрессии внутри Y’- и Х-элементов. Этого не наблюдается в искусственно укороченных теломерах, в которых присутствует градиент репрессии, распространяющийся на 3—4 т.п.н. от TG-повторов. Предполагается что природные теломеры образуют петли, аналогичные изображенным на рис. 4.6, в результате чего репрессированные области контактируют друг с другом, а не репрессированные остаются между областями контакта, (адаптировано из работы Pryde and Louis, 1999)}

^{Рис. 4.9. SIR-белки и Rap1 образуют кластеры по периферии ядра}

^{На панели а, Rap1 (зеленый) указывает на семь кластеров, представляющих все 64 теломеры данной диплоидной клетки Они расположены либо по периферии ядра, либо по соседству с ядрышком (голубое, помечено антителами к Nop1). ДНК помечена красным красителем. На панели б теломерная ДНК (красная) идентифицирована с помощью флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), а HML помечен зеленым красителем. Они имеют одинаковую локализацию примерно в 70% случаев и находятся рядом с ядерной оболочкой (синяя) (Heun et al. 2001). Панель в показывает фокальное распределение Sir4 (зеленый) рядом с ядерной оболочкой (помечена МаЬ414, красная). Такой характер распределения утрачивается в штамме с делецией yKu 70, что совпадает с утратой теломерного сайленсинга (Laroche et al. 1998)}

Исходно прикрепление теломер к ядерной оболочке, вероятно, происходит посредством yKu-зависимого пути, поскольку он работает даже в отсутствии сайленсинга. Благодаря этому прикреплению и взаимодействию между теломерами in trans происходит формирование ядерного субкомпартмента, который в свою очередь связывает SIR-белки (рис. 4.10). Этот компартмент имеет ключевое значение для образования градиента сайленсинга в области теломер. Даже фланкированные сайленсерами конструкты локуса НМ более эффективно репрессируются, когда интегрируются вблизи теломер (Thompson et al., 1994; Maillet et al., 1996) или когда они искусственно прикрепляются к ядерной оболочке трансмембранным фактором (Andrulis et al., 1998). Существенно, что способность усиливать репрессию за счет близости к теломерам утрачивается, когда Sir3 и Sir4 перестают захватываться кластерами или суперэкспрессируются (Maillet et al., 1996; Marcand et al., 1996). Это показывает, что градиент концентрации SIR-белков является той самой характеристикой теломерных кластеров, которая важна для усиления репрессии. Наконец, предполагается, что захват репрессоров общего назначения, присутствующих в лимитирующих концентрациях, помогает клетке обеспечить эпигенетическое наследование молчащего состояния, как показано на рис. 4.10. Вкратце, предложенная модель предполагает, что сборке вновь реплицированной ДНК в гетерохроматиновую структуру способствует ее локализация в субкомпартменте, обогащенном факторами сайленсинга.