3. RNAi и сборка гетерохроматина у S. pombe

Хромосомы S. pombe содержат в центромерах и «молчащих» локусах типа спаривания (mat2/3) обширные участки гетерохроматиновой ДНК. ассоциированные с лежащими в их основе повторяющимися элементами ДНК (Grewal, 2000; Pidoux and Allshire, 2004). Каждая центромера дробянковых дрожжей содержит уникальный центральный коровый район (cnt), который фланкируется повторами двух типов, называемыми самыми внутренними (imr — innermost) и самыми внешними (otr — outermost) повторами (рис. 8.2). Район otr сам состоит из повторов dh и dg.

Формирование гетерохроматина у S. pombe включает совместное действие ряда trans-действующих факторов Сюда входят деацетил азы гистонов (HDACs), Clr4, метилтрансфераза лизина 9 гистона H3 (HKMT) и белки, связывающиеся с H3K9-метилом гистона, Swi6 (гомолог НР1) и Chp1. Предполагается, что первоначальное рекрутирование Swi6 и Chp1 к хроматину приводит к распространению метилирования H3K9 и формированию гетерохроматина через последовательные циклы катализируемого Clr4 метилирования H3K9, сопряженного с опосредуемым Swi6 распространением на соседние нуклеосомы через его самоассоциацию (Grewal and Moazed, 2003).

Мутация в компонентах пути RNAi приводит, как это ни удивительно, к утрате центромерного гетерохроматина и накоплению некодирующих «прямых» и «реверсных» транскриптов с двунаправленных промоторов в пределах каждого повтора dgwdh (рис. 8.2) (Volpe et al., 2002). У дробянковых дрожжей есть единственный ген для каждого из белков RNAi, Dicer, Argonaute и RdRP (idcrl⁺, agol⁺n rdpl⁺, соответственно). Удаление любого из этих генов приводит к утрате метилирования H3K9 гистонов, и мутанты обнаруживают дефекты в расхождении хромосом, которые обычно связаны с дефектами в сборке гетерохроматина (Provost et al., 2002; Volpe et al., 2003). Более того, секвенирование библиотеки малых РНК дробянковых дрожжей выявило РНК длиной ~22 нуклеотида, которые картировались исключительно в районах центромерных повторов и повторов рибосомной ДНК, позволяя предполагать, что сел PHК могут образовывать dsRNAs, которые процессируются в siRNA (Reinhart and Bartel, 2002. Таким образом, было высказано предположение, что путь RNAi может рекрутировать Swi6 и Clr4 к хроматину для того, чтобы инициировать и (или) поддерживать формирование гетерохроматина в каждом из вышеуказанных локусов (рис. 8.3) (Hall et al., 2002; Volpe et al., 2002).

^{Рис. 8.2. Организация гетерохроматиновых районов хромосомы у S. pombe и A. thaliana}

^{В качестве примера показана центромера хромосомы 1 S. pombe. Уникальный центральный коровый район (cntl) фланкирован «самыми внутренними» (imrL и imrR) и «самыми внешними» (otrL и otrR) повторами. Район otr транскрибируется в обоих направлениях, давая начало прямым (синий) и обратным (красный) транскриптам. Участок между генами mat2 и mat3 содержит домен, который гомологичен центромерным повторам dg и dh (cenH) и также транскрибируется в обоих направлениях. Aftl и Perl — это связывающиеся с ДНК белки, которые действуют параллельно с RNAi, обеспечивая сайленсинг типа спаривания. Центромеры Arabidopsis состоят из повторов длиной 180 п.о. (зеленый), перемежающихся с элементами типа ретротранспозонов (желтый). Показаны прямые транскрипты, инициирующиеся в пределах длинного терминального повтора (LTR), и обратные транскрипты, инициирующиеся в пределах повторов длиной 180 п.о.}

Интересно, что и механизм TGS, и мехнизм PTGS, по-видимому, вносят вклад в даун-регуляцию сел-РНК.

Транскрипт с «прямой» нити в основном сайленсирован на транскрипционном уровне, как это видно на мутантах по RNAi (Volpe et al., 2002). Однако «обратная» нить транскриптов сел не затрагивается мутантами Swi6 (Volpe et al., 2002), и сайленсинг этого «обратного» cen-транскрипта происходит главным образом на посттранскрипционном уровне.

RNAi играет также роль в сайленсировании локуса типа спаривания (mat2/3) (Hall et al., 2002). mat2/3 прерывается участком ДНК, который в высокой степени гомологичен центромерным повторам (называется cenH — cenHomology) (рис. 8.2). Подобно повторам сел, район cenH транскрибируется дивергентно, образуя «прямые» и «обратные» РНК (Noma et al., 2004). Эти транскрипты cenH у мутантов по RNAi накапливаются до высоких уровней. Напротив, RNAi не является необходимой для сайленсинга репортерного трансгена, вставленного в mat2/3, если сайленсинг не был сначала как-то нарушен. Причина этого различия в том, что частично избыточный механизм сайленсинга, включающий два связывающихся с ДНК белка, Perl и Atfl, которые связываются с mat2/3, рекрутирует гетерохроматиновую машинерию независимо от RNAi (Jia et al., 2004). Этого достаточно для сайленсирования репортерного гена в отсутствие RNAi, но недостаточно для предотвращения накопления некодирующих транскриптов cenH (рис. 8.2).