9.1. Экспериментальная индукция специфических делеций в развивающемся макронуклеусе

Еще до того как посттранскрипционный сайленсинг генов был описан у Paramecium, было обнаружено, что введение клонированных последовательностей в большом числе копий в вегетативный макронуклеус изменяет ДНК-перестройки в половом потомстве трансформированных клонов. Удивительно, что последовательности, гомологичные трансгену, специфическим образом делегировались по неточному механизму, в то время как микронулеарный геном оставался интактным (рис. 7.6) (Meyer, 1992). Это явление, по-видимому, было весьма общим, поскольку все испытанные фрагменты ДНК могли производить делеции (Meyer et al., 1997). Эти эксперименты показывали, что в ходе половых событий сиквенс-специфичная информация передается через цитоплазму из трансформированного материнского макронуклеуса в развивающийся зиготический макронуклеус. Эта всеобщность данного эффекта говорила не в пользу тех трактовок, в которых роль отводилась сиквенс-специфичным ДНК-связывающим белкам, продуцируемым или титруемым инъецированными трансгенами. Наиболее экономное объяснение, согласующееся с наблюдаемой специфичностью, предполагает, что нуклеиновые кислоты, предположительно молекулы РНК, переносятся между ядрами и распознают свои мишени на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании.

^{Рис. 7.6. Индуцированные трансгеном делеции у Paramecium}

^{(а) У дикого типа ген А (красные стрелки) расположен вблизи гетерогенных концов макронуклеарной хромосомы; розовые прямоугольники = макронуклеарные теломеры. Паттерн перестроек макронуклеарной хромосомы надежно репродуцируется в ряду поколений, (б) Введение большого числа копий трансгенов А в материнский макронуклеус может индуцировать полную делецию эндогенного гена А в половом потомстве, когда новый макронуклеус развивается из производного зародышевой линии дикого типа. Новые макронуклеарные теломеры располагаются непосредственно «вверх по течению» от гена А}

Конструкты, которые эффективно индуцируют постзиготические делеции, являются неэкспрессибельными трансгенами, такими как трансгены, содержащие мутации типа сдвига рамки считывания или усечения 5’ или 3’ UTRs (Gamier et al., 2004). Те из них, которые могут продуцировать стабильные, способные транслироваться иРНК, не стимулируют элиминацию гомологичных генов из развивающихся макронуклеусов. Те же конструкты, которые стимулируют делецию ДНК, вызывают также сайленсинг эндогенных материнских генов в ходе вегетативного роста трансформированных клонов. Таким образом, постзиготические делеции коррелируют с презиготическим сайленсингом и с накоплением ~ 2 3 - нукл еотид н ых siRNAs. Эти siRNAs, как было показано далее, сохраняются в клетках на протяжении всего развития, что заставляет предполагать, что они могут отвечать за включение этих делеций.

Если ассоциированные с сайленсингом siRNAs направляют ДНК-перестройки, тогда введение dsRNA до начала или во время развития должно стимулировать элиминацию гомологичной последовательности в потомстве. Чтобы это проверить, клеткам Paramecium, которым скармливались E.coli штамма, продуцирующего dsRNA, гомологичную кодирующей последовательности ND7 — гену, участвующему в регулируемом экзоцитозе секреторных пузырьков, называемых трихоцистами, — дали возможность пройти автогамию и развить новые макронуклеусы из микронуклеусов дикого типа. Некоторое число поставтогамных потомков продемонстрировали мутантный фенотип ND7благодаря элиминации этого гена из их макронуклеусов (Gamier et al., 2004). Даже потомство фенотипически дикого типа показало частичную элиминацию копий гена ND7. Как и~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с трансген-индуцированным сайленсингом, ~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с кормлением dsRNA, сохранялись, как было показано, в этих клетках на протяжении всей аутогамии (Nowacki et al., 2005), подтверждая их участие в «нацеливании» постзиготических делеций. Явление индуцированной ДНК делеции, направляемой dsRNA, не ограничивается Paramecium. Микроинъекция конъюгирующим Tetrahymena смысловой и антисмысловой РНК, транскрибированной in vitro и гомологичной геномным локусам, в норме сохраняющимся в макронуклеусе, приводит к неточной делеции этих последовательностей (Yao et al., 2003).