2.2. Раннее развитие линии половых клеток у млекопитающих

Примордиальные половые клетки у мышей впервые обнаруживаются на стадии Е7.5 (на стадии раннего зачатка, ЕВ) как скопление примерно 40 клеток, которые являются основателями популяции линии половых клеток (Lawson and Hage, 1994; Mclaren, 2003). Эти клетки позитивны по щелочной фосфатазе и локализуются в пределах экстраэмбриональной мезодермы у основания аллантоиса (рис. 20.4, правая панель). Клональный анализ показал, что проксимальные клетки эпибласта на стадии Е6.0-Е6.5, стадии преполоски (PS) и первичной полоски (ES) дают начало PGC, а также тканям экстраэмбриональной мезодермы (Lawson and Hage, 1994). PGC формируются под влиянием сигнальных молекул, продуцируемым экстраэмбриональной эктодермой и первичной эндодермой (рис. 20.3). Втр4 и Втр8Ь являются сигнальными молекулами, которые регулируют компетентность и спецификацию половых клеток (Lawson etal., 1999).

Чтобы понять генетическую программу спецификации PGC, из единичных клеток PGC-основателей и окружающих их соматических клеток была получена кДНК (Saitou et al., 2002). Для того чтобы различить PGC и соматические клетки был использован ряд маркеров. При таком скрининге сначала был идентифицирован fragilis, новый белок семейства интерферониндуцируемых трансмембранных белков, и Stella, ядерно-цитоплазматический белок. Дальнейшие исследования показали, что fragilis экспрессируется в проксимальных клетках эпибласта на стадии Е6.25 (рис. 20.3), когда они становятся компетентными для образования как PGC, так и окружающих их клеток экстраэмбриональной мезодермы Fragilis-позитивные клетки во время гаструляции перемещаются в задний проксимальный район. Впоследствии среди этой популяции клеток обнаруживается популяция основателей PGC, экспрессирующих stella. Одновременно в основателях PGC обнаруживается экспрессия плюрипотентных генов, включая Sox2 и Oct4, что дает основание полагать, что PGC проявляют плюрипотентность, которая утрачивается соседними соматическими клетками. Напротив, в основателях PGC ряд генов репрессированы, включая Нахb1 и Haxa1, экспрессия которых в этот период значительно повышается в соседних соматических клетках. Репрессия Нах генов является частью механизма, который лежит в основе репрессии соматической судьбы основателей PGC (Saitou et al., 2002).

^{Рис. 20.3. Ранняя детерминация половых клеток у мыши}

^{Плюрипотентные проксимальные клетки эпибласта (синий), которые происходят из ICM (см. рис. 20.1 и 20.2) получают экстраклеточный сигнал В MP4 и становятся компетентными к развитию половых клеток (розовый). Активация Blimp1 коммутирует эти клетки к развитию в линию примордиальных половых клеток (красный), в то время как остальные клетки становятся соматическими}

Основываясь на анализе выхода основателей ППК, очевидно, что так же как и у других организмов, репрессия соматической программы является основной особенностью специализации PGC у мышей (Seydoux and Strome, 1999; Blackwell, 2004; Surani et al., 2004). Для определения кандидатов генной репрессии были проанализированы гистон лизин метилтрансферазы (НКМТ) с целью выяснить, существуют ли различия в их экспрессии в PGC и соседних соматических клетках. Экспрессия некоторых их этих генов, G9a, Pfm1, Set1 и EZh2 была выявлена как в PGC-основателях, так и в соматических клетках. Однако один ген, Blimp 1(В-lymphocyte maturation-induced protein 1), кодирующий белок, индуцирующий созревание лимфоцитов, экспрессировался только в основателях PGC, но не в соседних соматических клетках на стадии Е7 (Obinata et al., 2005). Blimp1 является репрессором транскрипции, содержит SET/PR домен, пролин-богатый район, который может рекрутировать Groucho и HDAC26, пять С₂Н₂ цинковых пальца, формирующих комплекс с G9a и кислым концом (Shaffer et al., 2002; Shapiro-Shelef et al., 2003; Gyori et al., 2004; Sciammas and Davis, 2004). Blimp1 впервые был идентифицирован, благодаря его роли при специализации плазматических клеток после репрессии В-клеточной программы в клетках-предшественниках (Turner et al., 1994). Blimp1 активно экспрессируется во время развития мыши (Chang et al., 2002).

Детальный анализ Blimp 1 в ранних эмбрионах мыши привел к неожиданным открытиям. Было установлено, что Blimp 1 начинает экспрессироваться в проксимальных клетках эпибласта на стадии Е6.25 в начале гаструляции, сначала только в 4–6 клетках, которые находятся в непосредственном контакте с клетками экстраэмбриональной эктодермы (рис. 20.3) (Obinata et al., 2005). Экспрессия Blimp 1 обнаруживается на одном конце короткой оси в участке, в котором будет сформирован задний проксимальный район. Число прогрессивно увеличивается, так что на стадии средней полоски их число достигает примерно 20; они формируют плотное скопление в заднем проксимальном районе на стадии Е6.75. На стадии Е7.5, раннего зачатка (ES), число Blimp 1-позитивных клеток увеличивается примерно до 40 (рис. 20.4). Эти клетки являются основателями PGC, экспрессируют классический PGC-маркер, щелочную фосфатазу, и в них начинается синтез stella (рис. 20.3). Эксперименты по генетическому прослеживанию линии подтвердили, что все Blimp 1-позитивные клетки, происходящие из эпибласта на стадии Е6.25 и далее, действительно являются клетками-предшественниками линии PGC. Эти данные находятся в противоречии с ранее существовавшей гипотезой, основанной на клональном анализе, согласно которой проксимальные клетки эпибласта на стадии Е6.0-Е6.5 не являются линиями ограниченными, дающими только PGC, поскольку клональные потомки индивидуальных клеток могут давать начало как соматическим, так и половым клеткам (Lawson and Hage, 1994; McLaren and Lawson, 2005). Это противоречие, вероятно, объясняется тем, что при клональном анализе маркированные клетки исходно могут быть Blimp 1-негативными, но при последующих делениях возникают позитивные клетки, которые дают PGC-клетки, в то время как дочерняя клетка дает соматических потомков. Механизм, который регулирует увеличение Blimp 1-позитивных клеток, пока неизвестен.

^{Рис. 20.4. Развитие половых клеток у разных видов животных}

^{У С. elegans специализация линии половых клеток (красный) начинается после первого деления зиготы с экспрессией Pie 1, которая приводит к транскрипционному покою Другая клетка (синий) дает начало соматическим клеткам. У D. melanogaster предшественниками половых клеток являются так называемые полюсные клетки, находящиеся на одной стороне зиготного синцития (многоядерного); транскрипционный покой в этих клетках зависит от локализации РНК гена Pgc У Mus musculus самые ранние предшественники половых клеток видны по экспрессии Blimp1 в основании аллантоиса. Blimp1 инициирует транскрипционный покой в этих клетках}