2.1. Инициация репликации ДНК контролируется эпигенетическими механизмами

Надежное копирование ДНК осуществляется ДНК-полимеразами, действующими от 5’- к З’-концу, и начинается в специфических сайтах, называемых «ориджинами» [точками начала репликации ДНК]. В «ориджинах» образуется «пузырь», состоящий из двухрепликационных «вилок», и репликация идет в двух направлениях, пока не встречаются «вилки», генерируемые следующими «ориджинами». Домены, реплицируемые с одного «ориджина», обычно очень большие, длиной в сотни тысяч пар оснований (Aladjem and Fanning, 2004). «Ориджины» у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (известные также как ARSs — autonomously replicating sequences, автономно реплицирующиеся последовательности) функционируют эктопически, будучи клонированы в плазмиды, и обычно после интеграции в другие хромосомные сайты, показывая тем самым, что инициация репликации регулируется специфическими последовательностями нуклеотидов ДНК. ARSs имеют величину приблизительно 100—150 п.н. и содержат одну или несколько копий важной последовательности длиной приблизительно 11 п.н. и обогащенной АТ плюс другие консервативные элементы (Weireich et al., 2004). Для инициации необходим белковый комплекс, известный как комплекс распознавания «ориджинов» (ORC, origin recognition complex), который отвечает за рекрутирование предрепликационного комплекса (PRC, prereplication complex), включающего белки поддержания минихромосом (МСМ, minichromosome maintenance proteins) (Prasanth et al., 2004). У многоклеточных «ориджины» репликации можно идентифицировать in situ, но обычно после клонирования и реинтродукции они не активны, что позволяет предполагать, что у этих организмов инициация регулируется эпигенетически, а не строгой зависимостью от последовательности ДНК (Aladjem and Fanning, 2004). Хотя у многоклеточных белки ORC и МСМ консервативны, факторы и механизмы, ответственные за регуляцию активности «ориджинов» у этих организмов, остаются загадкой. Кроме того, неясно, влияет ли структура хроматина на работу репликационных «вилок».

Ключ к тому, каким образом «ориджины» многоклеточных могли бы регулироваться эпигенетически, дают детальные исследования на S. cerevisiae. Хотя нуклеотидные последовательности ДНК в «ориджинах» необходимы и, по большей части, достаточны для инициации репликации у этого организма, имеются четкие данные о влиянии структуры хроматина на активность «ориджинов» (Weinreich et al., 2004). Анализ с использованием микрочипов (microarray analysis) показал, что не все из 332 сайтов двунаправленной репликации или из 429 сайтов связывания белков ORC и МСМ активны в каждом клеточном цикле. Хромосомный контекст и структура хроматина влияют на способность предполагаемого «ориджина» быть активным в инициации репликации. Например, ARS, локализованная в «молчащих» локусах типа спаривания, не может инициировать репликацию, если не будет перемещена в другие места хромосомы. Другой пример эпигенетической регуляции «ориджинов» относится к приблизительно 100—200 генам, кодирующим рибосомную РНК (rDNA), которые расположены в виде тандемных повторов (Pasero et al., 2002). Каждая единица rDNA длиной 9.1 т.п.н. содержит ARS, которая инициирует репликацию, будучи вставлена в плазмиду или в другое место генома. Однако в каждой S-фазе активны лишь около 20 % «ориджинов» rDNA.

«Ориджины» могут также регулироваться таким образом, что будут работать [to fire] на разных стадиях S-фазы (Weinreich et al., 2004). Например, «ориджины» возле теломер обычно активны в поздней S-фазе (см. раздел 2.3 далее в этой главе), но вставка тех же самых последовательностей в кольцевые плазмиды приводит к репликации в ранней S-фазе (рис. 14.3) (Ferguson and Fangman, 1992) Поздняя репликация может рекапитулировать в результате линеаризации такой плазмиды и добавления теломер, что помещает ARSs вблизи концов.

^{Рис. 14.3. Эпигенетическая регуляция сроков репликации у дрожжей}

^{Один из лучших примеров эпигенетических влияний на репликации был продемонстрирован у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Вставка поздно реплицирующегося «ориджина» в кольцевую плазмиду приводит к ранней репликации в S-фазе, а поздняя репликация восстанавливается после линеаризации этой плазмиды и добавления теломер (Ferguson and Fangman, 1992; Weinreich et al., 2004)}

Эти результаты показывают, что как активность «ориджинов», так и время начала работы «ориджина» в ходе S-фазы регулируются эпигенетически. Дальнейшие доказательства вытекают из наблюдений, согласно которым «расписание» S-фазы, сайленсинг «ориджинов» в rDNA, теломеры и локусы типа спаривания регулируются многими из модификаций гистонов и белками, отвечающими за эпигенетический сайленсинг генов, в том числе белками SIR (глава 4).