3.1. Нарушения геномного импринтинга
Открытие UPD было клинической «точкой входа» в нарушения геномного импринтинга у людей. В то время как PWS и синдром Ангелмана были первыми изученными нарушениями геномного импринтинга. синдром Беквита-Видемана (Beckwith-Wiedemann syndrome), псевдогипопаратироидизм и синдром Сильвера-Рассела (Silver-Russell syndrome) расширили этот список и поставили множество интригующих вопросов относительно того, как эпигенетические дефекты приводят к фенотипу, характерному для того или иного заболевания В следующем разделе мы даем краткий обзор клинических характеристик каждого нарушения, приводим разнообразные механизмы, ведущие к эпигенетипическим дефектам, а также описываем фенотипы и биологическую суть явлений, установленную в результате изучения этого типа нарушений (табл. 23.1).
Таблица 23.1. Выборочные нарушения геномного импринтинга
Сестринские синдромы: синдром Прадера-Уилли и синдром Ангелмана
Синдром Прадера-Уилли (PWS; OMIM 176270) и синдром Ангелмана (AS; OMIM 105830) в большинстве случаев вызываются одной и той же делецией 15q11-q13, размером 5—6 млн. нуклеотидов, но их фенотипы во многом различны. Геномный импринтинг в области 15q11-q13 объясняет эти фенотипические различия, с учетом того, что PWS вызывается делециями, унаследованными по отцовской линии, тогда как при AS делеции имеют материнское происхождение (Ledbetter et al., 1981; Magenis et al., 1987; Nicholls et al., 1989). PWS, который случается с частотой примерно 1/10000, был описан почти 50 лет назад и характеризуется младенческой гипотонией, задержкой развития, невозможностью роста вследствие плохого питания, апатией, за которыми следуют гиперфагия, тяжелое ожирение, низкоросл ость, вторичный гипогонадизм с гипоплазией гениталий и ослабление познавательных способностей. Пациенты с PWS также имеют отличительные физические черты, такие как небольшой размер кистей и стоп, миндалевидные глаза и тонкая верхняя губа. Большинство пациентов с PWS имеют слабое или среднее замедление умственного развития, подавляющее большинство из них проявляет разнообразные типы навязчиво-маниакального поведения, беспокойства, и иногда они замкнуты и несчастливы (рис. 23.4а). Наоборот, пациенты с AS имеют «счастливый настрой», часто улыбаются, и подвержены необъяснимым приступам смеха. Они страдают тяжелыми задержками развития, минимальными (если вообще имеют их) речевыми навыками. проблемами с равновесием (атаксией), производят аномальные похлопывающие движения кистями, характеризуются микроцефалией, припадками и некоторыми искаженными чертами, такими как выдающаяся нижняя челюсть и широкий рот (рис. 23.4б).
При обоих нарушениях могут наблюдаться гипотония, гипопигментация кожи и радужной оболочки и косоглазие. Большинство PWS и AS (-70%) вызваны отцовскими и материнскими делениями 15q11-q13, соответственно. Около 25% случаев PWS вызвано материнской UPD 15q11-q13, тогда как отцовская однородительская дисомия этого участка отвечает за 2—5% пациентов с AS (рис. 23.3). Разница в частоте однородительской дисомии между PWS и AS обычно инициируется материнским нерасхождением, поскольку на него влияет возраст матери, приводящий к зачатиям с трисомией или моносомией по хромосоме 15. Эти случаи затем подвергаются «спасению», что приводит к материнской UPD и PWS или отцовской UPD и AS, соответственно. Разница в частоте встречаемости этих двух однородительских дисомий предположительно связана с частотой образования двух аномальных яйцеклеток и с вероятностью «спасения» при обоих этих обстоятельствах. Транслокации в пределах критического PWS/AS участка отвечают менее чем за 10% таких случаев, но следует заметить, что такие транслокации связаны с высоким риском рецидива (до 50%), в зависимости от пола передающего родителя. Действительно, PWS и AS сосуществовали в некоторых семьях благодаря транслокациям или другим структурным аномалиям 15q11-q13, и фенотип при этом определялся полом передающего родителя (Hasegawa et al., 1984; Smeets et al., 1992).
Рис. 23.3. Синдром Прадера-Вилли и синдром Ангелмана
Оба синдрома могут быть вызваны генетическими, эпигенетическими или смешанными дефектами
Рис. 23.4. Пациент с синдромом Прадера-Уилли (а) и пациент с синдромом Ангелмана (б)
Эти фотографии иллюстрируют существенные различия в клинической картине нарушений, вызванных дефектами в импринтированном участке. Фотографии любезно предоставлены Д-рами Daniel J Driscoll (а) и Carlos A. Bacino (б)
Дефекты импринтинга представляют еще один класс мутаций, ведущих к фенотипам PWS или AS. Такие дефекты, которые включают в себя разделенный на две части центр импринтинга (1 С) в пределах 15q11-q13 (Ohtaet al., 1999), являются причиной того, что хромосома, принадлежащая по происхождению одному из родителей, имеет измененный эпигенотип, как правило, эпигенотип хромосомы, происходящей от другого родителя. Дефекты импринтинга часто включают в себя делецию 1C, но есть случаи, когда такие дефекты оказываются имеющими место благодаря эпигенетической мутации, не затрагивающей последовательность нуклеотидов ДНК. Итог таких разнообразных нарушений импринтинга один и тот же, и он включает в себя изменения в метилировании ДНК, структуре хроматина и, в конечном счете, паттерны экспрессии генов. Дефекты импринтинга объясняют 2—5% случаев PWS и AS, а делеции в 1C обычно ассоциируются с 50%-ным риском рецидива, в зависимости от пола родителя, передающего аномалию, тогда как риск рецидива в семьях без делеции в 1C невысок. Идентификация дефектов импринтинга у небольшого количества пациентов с AS, которые были зачаты после инъекции спермы в цитоплазму яйцеклетки (ICSI, intracytolasmic sperm injection), поставила вопрос о том, что, возможно, этот способ оплодотворения in vitro вызывает дефекты импринтинга (Сох et al., 2002; Orstavik et al., 2003). Обнаружение дефектов импринтинга среди случаев AS у пациентов, родившихся у субфертильных родительских пар, не прошедших процедуру ICSI (но подвергнутых гормональной стимуляции), порождает дальнейшие вопросы относительно того, имеют ли бесплодие и дефекты импринтинга общие механизмы, или действительно вспомогательные репродуктивные технологии [гормоны и (или) ICSI] имеют эпигенетические последствия (Ludwig et al., 2005).
Какой конкретно ген (гены) затрагивается геномным импринтингом в 15q11-q13, известно лишь для AS, но не для PWS. Около 10—15% случаев AS вызываются мутациями потери функции в гене лигазы ЕЗ убиквитина (UBE3A), кодирующем белок, связанный с Е6 (Е6-АР, E6-associated protein) (Kishino et al., 1997; Matsuura et al., 1997). Изучение экспрессии показало, что Ube3a экспрессируется исключительно с материнской аллели в мозжечковых клетках Пуркинье и в нейронах гиппокампа. Более того, мыши Ube3a+, лишенные материнской аллели, воспроизводят черты AS (Jiang et al., 1998). Эти результаты, так же как и данные по человеку, указывают на ген UBE3A, как на первопричину AS. Отцовская UPD или материнские делеции в 15q11-q13, ведут к потере экспрессии UBE3A в клетках Пуркинье. В случае дефектов импринтинга в 1C оказывается, что потеря сайленсинга антисмыслового транскрипта ведет к подавлению экспрессии гена UBE3A (Rougeulle et al., 1998). Интересно, что около 10% случаев AS остаются без молекулярного диагноза. Оказывается, что у ряда пациентов имеются мутации в белке ремоделинга хроматина — белке 2, связывающемся с метил-CpG, — что обсуждается ниже.
В случае PWS есть несколько кандидатов на роль импринтирующих генов, которые экспрессируются только с отцовской аллели, однако не ясно, которые из этих генов ответственны за фенотип PWS. Наиболее подходящими кандидатурами до сих пор являются гены в кластере некодирующих малых ядрышковых РНК (snoRNAs). Из белок-кодирующих генов наилучшими кандидатами являются SNURF-SNRPN и Necdin (NDN). Главный сайт старта транскрипции SNURF-SNRPN расположен в 1C и он кодирует малый ядерный рибонуклеопротеин (SN-RPN), который функционирует в регуляции сплайсинга. Считается, что главным сайтом дефектов импринтинга является еще один ген «рамка считывания вверх по течению от SNRPN» (или SNURF), наряду с некодирующими экзонами, расположенными «вверх по течению», потому что разрушение (дизрупция) этого гена ведет к изменению импринтинга SNRPN и других импринтированных генов 15q11-q13. Мыши с отсутствием Snrpn выглядят нормальными, а мыши с делециями, захватывающими Snrpn и другие гены, гомологичные генам в 15q11-q13, характеризуются гипотонией, задержкой роста, и погибают еще до окончания вскармливания (Tsai et al., 1999). Несколько генов малых ядрышковых РНК (snoRNA) экспрессируются с отцовской аллели и, возможно, вносят свой вклад в фенотип PWS (Meguro et al., 2001). Недавние исследования показали, что потеря отцовской аллели из одного кластера этих генов (HBI1-52) не вызывает PWS (Runte et al., 2005). Однако исследования на мышах заставляют предполагать, что утрата малой ядрышковой РНК Pwcr1/MBII-85, вероятно, отвечает за неонатальную смертность в моделях PWS, разработанной на мышах (Ding et al., 2005). Следовательно, PWS может вызываться потерей одного и более генов малых ядрышковых РНК, возможно, в сочетании с потерей других генов, экспрессирующихся в 15q11-q13 по отцовской линии. Тщательное исследование редких семей с транслокациями и делециями поддерживает мнение, что недостаточность по малым ядрышковым РНК PWCR1/HBII-85 вызывает PWS (Schulc ct al., 2005).
Синдром Беквита-Видемана
История синдрома Беквита-Видемана (BWS; OMIM 130650) представляет собой блестящий пример того, как заболевание человека вскрыло значение эпигенетики не только в нормальном развитии, но и при регуляции роста клеток и при опухолеобразовании. Синдром Беквита-Видемана характеризуется быстрым и гипертрофическим соматическим ростом, врожденными аномалиями и предрасположенностью к эмбриональным злокачественным перерождениям в детском возрасте (Weksberg et al., 2003). У пациентов с BWS в типичных случаях проявляется гигантизм, макроглоссия (увеличенный язык), гемигипертрофия разнообразные степени аномалии ушей и других органов и пупочная грыжа (выпячивание органов брюшной полости через пупок). Кроме того, многие пациенты страдают увеличенным размером внутренних органов; эмбриональными опухолями, такими как опухоль Уилмса (Wilms’ tumor), гепатобластома или рабдомиосаркома, а также гиперплазией и гипертрофией островков поджелудочной железы, часто приводящей к неонатальной гипогликемии.
Большинство случаев BWS носят спорадический характер, но наличие небольшого числа семей с паттерном аутосомно-доминантного наследования (в ретроспективе, после модификации геномным импринтингом) наводит на мысль о его генетической этиологии и связи синдрома с 11р15 (Pingetal., 1989). Преимущественная потеря материнских аллелей в опухолях, связанных с BWS, избыток женщин, передающих данное заболевание при его доминантной форме, и отцовская UPD по 11р15.5 в некоторых случаях BWS, свидетельствуют в пользу того, что эпигенетика и импринтинг должны играть важную роль в этиологии BWS, и что это заболевание может быть результатом смеси генетических и эпигенетических аномалий, либо возникших de novo, либо унаследованных. Кластер импринтированных генов, связанных с BWS, картируется в 11р15.5 в участке размером приблизительно 1 млн о. и включает в себя по меньшей мере 12 импринтированных генов. Считается, что эти гены регулируются двумя центрами импринтинга, разделенными неимпринтированным участком (Weksberg et al., 2003). Предполагается, что реципрокно импринтированный Н19 и инсулиноподобный фактор роста (IGF2) и дифференциально метилированный район представляют собой один участок контроля импринтинга (ICR1 - imprinting control region) (Joyce et al., 1997; Weksberg et al., 2003). H19кодирует экспрессируемую по материнской линии некодирующую PHKpol [I, a IGF2 кодирует экспрессируемый по отцовской линии фактор роста У этих двух генов общий стандартный набор энхансеров, на доступ к которым влияют статус метилирования ICR1 и связывание с белком CTCF (белком типа «цинкового пальца») (Hark et al., 2000). Второй участок контроля импринтинга (ICR2) содержит несколько генов, экспрессирующихся по материнской линии, в том числе: ингибитор циклин-зависимой киназы (CD-KN1C, кодирующий p57kip2), компонент калиевого канала (KCNQ1) и предполагаемый переносчик катионов (SLG22A1L). Дифференциально метилированный район в ICR2 картируется в интроне KCNQlu на отцовских аллелях он не метилирован, что ведет к экспрессии КС-NQIOTI в антисмысловом направлении KCNQ1. Предполагается, что метилирование ICR2 на материнской аллели сайленсирует материнскую экспрессию KCN-QIOTI, делая возможной экспрессию KCNQ1 и CDKN1C, экспрессирующихся по материнской линии (Lee et al, 1999; Smilinichet al., 1999).
Различные эпигенетические, а также генетические молекулярные дефекты дают некоторое понимание относительно того, какие гены вносят вклад в фенотип BWS. На неметилированных материнских аллелях CTCF связывается с ICR1 и устанавливает границу, посредством чего промотор IGF2 изолируется от энхансеров. Эти энхансеры могут потом получить доступ к промотору Н19 (более проксимальное положение относительно границы), разрешая транскрипцию Н19. Метилирование ICR1 на отцовских аллелях аннулирует связывание с CTCF, разрешая экспрессию IGF2 и сайленсинг Н19. Обнаружение того, что либо дупликации в 11р15.5, распространяющиеся на локус IGF, либо отцовская UPD данного участка (ожидается, что она приводит к сверхэкспрессии IGF2), в сочетании с данными, показывающими, что у трансгенных мышей со сверхэкспрессией IGF2 развиваются чрезмерно быстрый рост и увеличенный язык, подразумевает, что сверхэкспрессия IGF2 является одной из возможных причин гипертрофированного роста при BWS (Henry et al., 1991; Weksberg et al., 1993; Sun et al., 1997). Любопытно, что мутации типа потери функции в гене CDKN1C дают начало BWS, аналогично мутациям, вызываемым сверхрэкспрессией IGF2. У мышей, не имеющих Cdknlc, развиваются пупочные грыжи, но не усиленный рост. Однако, когда утрата Cdknlc сочетается с повышенной экспрессией Igf2, животные воспроизводят многие черты BWS (Caspary et al., 1999). К настоящему времени к молекулярным нарушениям, которые вызывают BWS, относятся: 1) отцовские дупликации, включающие IGF2, 2) отцовскую UPD по 11р15.5,3) мутации типа потери функции в материнской аллели CDKN1C, 4) трансляции на материнской хромосоме, нарушающие KCNQ1, влияющие на импринтинг IGF2но, как ни странно, не на ICR2, и 5) чаше всего — потеря импринтинга ICR2/KCNQiOTl, что, опять-таки, изменяет импринтинг IGF2 и предполагает некоторые регуляторные взаимодействия между ICR1 и ICR2 (Cooper et al., 2005). Некоторые эпигенетические изменения, идентифицированные при BWS, такие как дефекты метилирования в ICR1 гена Н19, также были подтверждены у пациентов с опухолью Уилмса, но не с BWS; это предполагает, что хронометраж эпигенетического дефекта может диктовать, будет ли аномальная регуляция роста затрагивать весь организм или только какой-то специфический орган. Тот факт, что аберрантное метилирование в IRC1 часто приводит к опухоли Уилмса, а в ICR2 — часто приводит к рабдомиосаркоме и гепатобластоме при BWS, предполагает, что в 11р15.5 имеется более чем один локус, обусловливающий предрасположенность к канцерогенезу (Weksberg et al., 2001; DeBaun et al., 2003; Prawitt et al., 2005).
Синдром Силвера-Рассела
Синдром Силвера-Рассела (SRS, Silver-Russell syndrome; OMIM 180860) — это нарушение развития, характеризующееся замедлением роста, невысокой фигурой, часто ассиметричной, и несколько бесформенными чертами лица и черепа, а также аномалиями пальцев. Наиболее заметная характеристика — это аномалии соматического роста, другие характеристики сильно варьируют. Генетически SRS гетерогенен, но подсчитано, что около 10% случаев являются результатом материнской UPD по хромосоме 7 (Eggermann et al., 1997). Предполагается, что SRS вызывается потерей функции гена, экспрессированного у отца (возможно, того, который способствует росту); но нельзя исключить альтернативную модель, а именно, сверхэкспрессию гена, подавляющего рост и экспрессированного у матери Интересно, что у некоторых индивидуумов с SRS была обнаружена эпигенетическая мутация, вызывающая деметилирование ICR1 на хромосоме 11р15. Этот эпигенетический дефект вызывает биаллельную экспрессию Н19 и пониженную экспрессию IGF2 (Gicquel et al., 2005).
Псевдогипопаратироидизм
Псевдогипопаратироидизм (РНР, pseudohypoparathyroidism) представляет собой группу фенотипов, являющихся результатом функционального гипопаратироидизма, несмотря на нормальный уровень паратироидного гормона (РТН, parathyroid hormone). Такие пациенты устойчивы к РТН (паратироидному гормону). Существует несколько клинических подтипов — la, lb, 1с, II и наследуемая остеодистрофия Олбрайта (OMIM 103580). Кроме функционального псевдогипопаратироидизма и остеодистрофии эти клинические варианты могут проявлять ряд соматических дефектов и дефектов развития. Гетерогенные с клинической точки зрения фенотипы являются результатом мутаций в гене GNAS1, кодирующем полипептид 1 (Gsa) — белок, обладающий a-стимулирующей активностью и связывающийся с гуанином. GNAS1 картируется в хромосоме 20q 13.2. Локус GNAS1 имеет три альтернативных первых экзона, расположенных «вверх по течению» (экзоны 1А, XL, и NESP55), которые сплайсированы с экзонами 2-13 и производят разные транскрипты, и в случае с NESP55 и XL этот альтернативный сплайсинг продуцирует уникальные белки Около этих экзонов имеются дифференциально метилированные участки, принуждающие NESP55 экспрессироваться исключительно с материнских аллелей, тогда как XL, экзон 1А и антисмысловой транскрипт для NESP55 экспрессируются у отца. Хотя транскрипт, кодирующий белок Gsa, экспрессирован биаллельно, в некоторых тканях, таких как проксимальные почечные канальцы, преимущественно экспрессирована материнская аллель. Сочетание геномных и тканеспецифичных импринтингов объясняет изменчивые фенотипы и эффект происхождения от одного или другого родителя даже для тех мутаций, которые имеют ясный аутосомный доминантный паттерн наследования (Hayward et al., 1998). Следует отметить, что у одного пациента с отцовской UPD участка GNAS1 развилось заболевание по типу lb (Bastepe et al., 2003).
Изучение генотипов и фенотипов этих клинических нарушений показало, что за исключением SRS все остальные геномные нарушения импринтинга (PWS, AS, BWS, и РНР) могут быть вызваны смесью генетических или эпигенетических аномалий, либо возникших de novo, либо унаследованных. Трудно поверить, что такая смешанная генетическая модель заболевания будет оставаться уникальной для этого небольшого набора нарушений. Немногим более десятилетия назад UPD была лишь теоретической возможностью, но сейчас установлено, что она имеет место на многих участках хромосом и приводит к разнообразным заболеваниям и фенотипам, касающимся развития. Одна из задач исследований генетики человека — выявить, какие гены отвечают за те или иные из ассоциированных с UPD фенотипов с целью установить список болезней, которые, вероятно, являются результатом смешанных генетикоэпигенетических механизмов.