1.6. Транскрипция центромерных повторов РНК-полимеразой II связывает RNAi с модификациями хроматина

В предыдущем разделе было показано, что RNAi и модификации гистонов необходимы для сборки центромерного гетерохроматина, который может распространяться на соседние вставленные репортерные гены. Эти наблюдения поднимают такие очевидные вопросы, как вопрос о том, каким образом RNAi связана с ковалентной модификацией гистонов в формировании «молчащего» хроматина, и вопрос о том, как конкретные районы генома становятся мишенью для такой направляемой RNAi модификации хроматина и сайленсинга.

У многих организмов экспрессия специфических dsRNA, гомологичных рассматриваемому гену, приводит либо к транскрипционному (модификация ДНК/хроматина) сайленсингу гена (TGS), либо к посттранскрипционному (деградация иРНК) сайленсингу гена (PTGS). Может ли любая dsRNA у дробянковых дрожжей процессироваться так, что образует siRNAs, и индуцируют ли такие siRNAs только посттранскрипци-онный сайленсинг (РНК-нокдаун) или же они могут осуществлять также и модификации хроматина (например, H3K9me2), которые сайленсируют транскрипцию с гомологичного гена? Экспрессия dsRNAs, гомологичных репортеру GFR, продуцирует siRNAs, которые вызывают редукцию транскриптов GFP, но транскрипционная активность репортерного гена GFP не снижается

Таким образом, хотя GFP-siRNAs понижают уровни иРНК GFP, они не способны осуществлять модификации хроматина, которые приводят к транскрипционному сайленсингу. Эти GFP-siRNAs должны, следовательно, действовать лишь посттранскрипционно, разрушая иРНК GFP (Sigova et al., 2004). Неясно, почему GFP-siRNAs не индуцируют модификацию хроматина на гомологичном гене, но это может быть связано с природой синтезирующегося транскрипта или с силой промотора RNA pol II, приводящей в действие экспрессию GFP.

Какая РНК-полимераза отвечает за транскрипцию центромерных повторов? Мутация любой из двух субъединиц RNApol II (Rpb2 и Rpb7) приводит к дефектному сайленсингу центромер (Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005), хотя эти мутации демонстрируют очень разные фенотипы. У мутанта rpb7-1 обнаруживаются пониженные уровни транскрипции центромерных повторов, что приводит к меньшему образованию ncRNA и, следовательно, меньшему образованию siRNA и утрате «молчащего» хроматина. Это означает, что RNA pol II необходима для транскрипции центромерных повторов, чтобы обеспечить первичный субстрат для RNAi. Напротив, у мутанта грЬ2-т203 центромерные транскрипты образуются, но они не процессируются в siRNA, и содержание H3K9me в центромерах уменьшается. Эти исследования показывают не только то, что для RNAi требуется транскрипт RNApol II, но и что, подобно другим событиям процессинга РНК, образование центромерной siRNA может быть сопряжено с транскрипцией через взаимодействия между машинерией RNAi, хроматином, модифицирующими ферментами и RNA pol II (рис. 6.6). Возможно, что ассоциированные с RITS siRNAs могут «наводиться» на синтезируемые транскрипты по мере того, как они появляются из RNA pol II, занятой гомологичным локусом. Коль скоро происходит узнавание, комплекс RITS-siRNA мог бы стабилизироваться на этих транскриптах, результатом чего могло бы стать рекрутирование таких модифицирующих хроматин активностей, как Clr4 Удивительно, что центромерные siRNAs также исчезают в клетках, лишенных активности HKMT Clr4 (Noma et al., 2004; Hong et al., 2005). Возможно, что отсутствие Clr4 влияет на продукцию siRNA путем дестабилизации связей между различными компонентами в интерфейсе между транскрипцией, RNAi и модификацией хроматина (Motamedi et al., 2004). Альтернативная возможность сводится к тому, что метилирование H3K9 может быть необходимо для того, чтобы сделать возможным генерацию siRNAs в cis-конфигурации посредством действия различных активностей, осуществляющих процессинг РНК (например, RdRP), на первичные центромерные транскрипты (рис. 6.6) (Noma et al., 2004; Sugiyama et al., 2005; глава 8).