11.1. Связь коротких РНК с элиминацией ДНК

У Tetrahymena каноническая модификация гетерохроматина, H3K9-метилирование, маркирует хроматин, связанный с IESs, непосредственно перед их вырезанием. Каким образом эта модификация осуществляет специфическое «нацеливание» на эти сегменты ДНК, предназначенные для элиминации? Был описан RNAi-подобный путь, который использует RNA-гиды, чтобы направить ее на соответствующие локусы (обзор см. Mochizuki and GorovskY, 2004; Yao and Chao, 2005). Первоначальным указанием на то, что делеция ДНК использует молекулы гомологичных РНК, явилось наблюдение, что у Tetrahymena IESs двунаправлено транскрибируются на ранних этапах конъюгации (Chalker and Yao, 2001). Реальный прорыв случился, когда Mochizuki и др. (2002) идентифицировали белок семейства PIWI/Argonaute, кодируемый геном TWI1, который экспрессируется в ходе развития и необходим для перестройки ДНК (Mochizuki et al., 2002) Поскольку белки Argonaute являются ключевыми игроками в процессах, включаемых RNAi, эти исследователи искали и нашли такой класс эндогенных малых (-28 нуклеотидов) РНК, которые предпочтительно комплементарны к последовательностям, ограниченным зародышевой линией. Деструкция гена TWI1 дестабилизировала эти короткие РНК и ликвидировала метилирование H3K9 в развивющемся соматическом ядре. Эта работа, опубликованная в 2002 году, в совокупности с экспериментами на Schizosaccharomyces pombe (главы 6 и 8) утвердила новую парадигму, согласно которой

гетерохроматин генерируется действием гомологичных РНК, «нацеливающих» метку сайленсинга (H3K9) на специфичные локусы.

Характеристика гена DCLl, кодирующего рибонуклеазу Dicer, осуществляющую процессинг двусторонних транскриптов в ~28-нуклеотидные малые РНК, обеспечила еще более глубокое проникновение в общую регуляцию этого процесса (Malone et al., 2005; Mochizuki and Gorovsky, 2005). Этот белок экспрессируется на высоком уровне на ранних этапах конъюгации и локализуется в премейотических микронуклеусах, что указывает на то, что генерация малых РНК компартментализована во времени и пространстве в пределах этого ядра зародышевого пути. Разрушение гена DCL1 вызывало утрату способности производить малые РНК, аккумуляцию транскриптов зародышевой линии и, в конечном счете, неспособность к вырезанию IES. Интригующим моментом является то, что утрата малых РНК не ликвидирует метилирование H3K9, как это наблюдалось в линиях с нокаутом по TWI1. Тем не менее, анализ с помощью иммунопреципитации хроматина показал, что эта модификация больше не является обогащенной на IESs; таким образом, малые РНК необходимы для того, чтобы «нацеливать» эту модификацию хроматина на нужные локусы (Malone et al., 2005).

Чтобы объяснить роль материнского генома в регуляции этих событий, была предложена модель сканирующей РНК (Mochizuki et al., 2002). В варианте этой модели, изображенном на рис. 7.9, 28-нуклеотидные «сканирующие» РНК, генерируемые в микронуклеусе, - связываются с RISC-подобным комплексом в цитоплазме, содержащим Twil, и изначально направляются в материнский макронуклеус. Здесь они сканируют существующий перестроенный геном на наличие гомологии. Те scnRNAs, которые спариваются с материнскими последовательностями, удаляются из пула активных комплексов. Остающиеся scnRNAs, ассоциированные с Twil, транспортируются затем в развивающийся макронуклеус, где они «нацеливают» метилирование H3K9 на гомологичные последовательности, маркируя их для вырезания с помощью механизма перестройки ДНК. Эта модель подкрепляется далее наблюдением, согласно которому Twil локализуется в материнском макронуклеусе на ранних этапах развития после образования основной массы малых РНК, но до появления предшественников новых макронуклеусов. Таким образом, регулируемый трафик комплексов малых РНК и белков облегчает сравнение соматического генома и генома зародышевой линии.