3.3. Получение клонированных млекопитающих из терминально дифференцированных клеток
Состояние дифференцировки донорской клетки и эффективность репрограммирования ядра
Вопрос, уже возникавший в плодотворных экспериментах по клонированию у амфибий, заставлял предполагать наличие обратной зависимости между состоянием клеточной дифференцировки донорского ядра и его способностью направлять развитие после пересадки в яйцеклетку (см. выше и рис. 22.3). Важно было выяснить, влияет ли состояние дифференцировки донорской клетки на эффективность репрограммирования и у млекопитающих. Как показано в табл. 22.2, репрограммирование можно измерить функционально, оценив развитие клонов на нескольких разных уровнях, включая (1) скорость формирования бластоцисты после пересадки ядра в яйцо, (2) долю клонированных эмбрионов, выживающих до рождения или до взрослого состояния после имплантации в матку, и (3) частоту, с которой из клонированных бластоцист, эксплантированных в культуру, можно получить плюрипотентные эмбриональные стволовые (ES) клетки.
Эффективность предимплантационного развития реконструированных ооцитов в бластоцисты особенно
чувствительна к таким экспериментальным параметрам, как стадия клеточного цикла и физическое состояние пересаживаемого ядра. Например, клонирование неделящихся донорских клеток более эффективно, чем клонирование активно пролиферирующих клеток (Campbell et al., 1996а; Cibelli et al., 1998). Так, как и ожидалось из этого отношения, яйцеклетки, реконструированные с использованием донорских ядер из фибробластов, клеток Сертоли, кумулюса или клеток NKT, находящихся в фазе Gj или G0 клеточного цикла, достигают стадии бластулы с относительно высокой эффективностью в противоположность клеткам ES или клеткам эмбриональной карциномы (ЕС), которые активно делятся и большая доля которых находится в фазе S (табл. 22.2). Благодаря экспериментальной вариабельности в ходе дробления измерение доли бластоцист, полученных из реконструированных ооцитов, не является надежным критерием для количественной оценки «способности к репрограммированию». Однако, коль скоро клонированный эмбрион достиг стадии бластоцисты, после имплантации в матку его развитие до рождения зависит от состояния дифференцировки донорского ядра. Клонированные эмбрионы, полученные от таких эмбриональных доноров, как клетки ES или ЕС, развиваются до рождения с эффективностью в 10—20 раз более высокой, чем эмбрионы, полученные от донорских клеток кумулюса или фибробластов (Eggan et al., 2001; Wakayama and Yanagimachi. 2001). предположительно потому, что ядро недеференцированной клетки более склонно к репрограммированию или нуждается в нем в меньшей степени, чем ядро дифференцированной соматической клетки. Это указывает на обратное отношение между стадией дифференцировки донорской клетки и эффективностью репрограммирования. Наконец, коль скоро эмбрион достиг стадии бластоцисты, он с довольно существенной вероятностью может дать начало клеткам ES; это показывает, что получение клеток ES из эксплантированных бластоцист гораздо меньше зависит от состояния дифференцировки донорского ядра (табл. 22.2).
Можно ли ядра терминально дифференцированных клеток репрограммировать до состояния тотипотентности ?
В ранних экспериментах по клонированию амфибий и млекопитающих популяции донорских клеток, используемых для трансплантации ядер, были гетерогенными, и нельзя было исключить, что начало редким выживающим клонам дали редкие взрослые стволовые клетки, присутствующие в донорской популяции, а не ядра дифференцированных клеток. Например, эпигенетическое состояние соматических стволовых клеток может походить на состояние эмбриональных стволовых клеток, легче репрограммируется и, таким образом,может предпочтительно давать выживающие клоны. Чтобы решить вопрос о том, можно ли ядро терминально дифференцированной клетки репрограммировать в достаточной мере для получения взрослого животного, требовались генетические маркеры, по которым можно было бы ретроспективно идентифицировать донорское ядро выжившего клона. Такие маркеры были использованы для однозначной демонстрации того, что ядра из зрелых иммунных клеток, из терминально дифференцированных нейронов и из злокачественных раковых клеток могут быть репрограммированы и могут дать взрослых клонированных мышей.
Моноклональные мыши из зрелых иммунных клеток
Моноклональные мыши были получены с использованием ядер периферических лимфоцитов, где генетические перестройки генов иммуноглобулина (Ig) и рецептора Т-клеток (TCR) можно было использовать в качестве стабильных маркеров, позволяющих выявлять идентичность и состояние дифференцировки донорского ядра данного клона. Поскольку предшествовавшие попытки получить моноклональных мышей были безуспешными, использовали процедуру двухэтапного клонирования, чтобы сначала получить клетки ES из клонированных бластоцист, а затем, на втором этапе, моноклональных мышей из клонированных клеток ES (рис. 22.6). Животные, полученные из донорских ядер В- и Т-клеток, были жизнеспособными и несли полностью перестроенные гены иммуноглобулина или TCR во всех тканях (Hochedlinger and Jaenisch, 2002). Как и ожидалось, иммунные клетки моноклональных мышей экспрессировали только те аллели локуса Ig и TCR, которые были продуктивно перестроены в соответствующих донорских клетках, использованных для пересадки ядер, а перестройка других генов Ig или TCR была подавлена. Эти результаты однозначно показывают, что ядра из терминально дифференцированных донорских клеток могут быть репрограммированы до состояния плюрипотентности с помощь клонирования ядер. Частота непосредственно получаемых клонированных эмбрионов из зрелых В- и Т-клеток (вместо двухэтапной процедуры, использованной в наших экспериментах), хотя ее и трудно оценить, была, вероятно, существенно ниже, чем частота клонов, полученных из фибробластов или клеток кумулюса (возможно, меньше I на 2000 оперированных эмбрионов; табл. 22.2). Недавно были непосредственно клонированы терминально дифференцированные клетки NKT (Inoue et al., 2005). Клетки NKT, подобно В- и Т-клеткам, обладают генетическими перестройками, делающими возможной ретроспективную идентификацию состояния дифференцировки этих клеток. Однако, хотя Т- клетки и клетки NKT и являются частью одной и той же клеточной линии, соответствующая эффективность ядерных пересадок существенно различалась (Hochedlinger and Jaenisch, 2002; Inoue et al., 2005).
Рис. 22.6. Двухэтапная процедура для получения моноклональных мышей из зрелых лимфоидных донорских клеток
(1) Ядра из клеток периферического лимфатического узла пересаживали в денуклеированные яйцеклетки и получали клонированные бластоцисты. Эти бластоцисты эксплантировали in vitro и получали клонированные клетки ES. (2) На втором этапе получали моноклональных мышей путем тетраплоидной комплементации (Eggan et al., 2001; Hochedlinger and Jaenisch, 2002)
Клонированные мыши из зрелых обонятельных нейронов
В противоположность В- и Т-клеткам ядра постмитотических нейронов необратимо выходят из клеточного цикла; в этом заключается часть программы их дифференцировки. Для проверки того, можно ли ядро зрелого нейрона репрограммировать до состояния тотипотентности, были получены фертильные клонированные взрослые мыши из постмитотических обонятельных нейронов с использованием такого же подхода, какой был применен для получения моноклональных мышей (см. рис. 22.6) (Eggan et al., 2004; Li et al., 2004). Как показано в табл. 22.2, эффективность получения клонированных клеток ES из обонятельных нейронов была в том же диапазоне, что и эффективность для ядер иммунных клеток. Эти наблюдения показывают, что постмитотическое нейрональное ядро может вновь вступить в клеточный цикл и его можно репрограммировать к плюрипотентности.
У мыши каждая из двух миллионов клеток в обонятельном эпителии экспрессирует только один из приблизительно 1500 генов рецепторов запаха (OR, odor-ant receptor), так что функциональная идентичность нейрона определяется природой рецептора, который он экспрессирует (это аналогично моноаллельной экспрессии генов иммунного глобулина или TCR в В- или Е-клетках, которая обсуждалась в главе 21). Один из механизмов, который обеспечивал бы стохастический выбор единственного обонятельного рецептора, мог бы быть связан с перестройками ДНК. Получение мышей, клонированных из зрелых обонятельных нейронов, позволило исследовать, связан ли выбор обонятельного рецептора с необратимыми перестройками ДНК. Если выбор обонятельного рецептора связан с необратимыми перестройками ДНК, можно было бы предсказать, по аналогии с описанными выше моноклональными мышами, что мышь, клонированная из нейрона, экспрессирующего Р2, будет экспрессировать этот рецептор во всех обонятельных нейронах и репертуар экспрессии рецепторов будет изменен (это были бы моносомные мыши, которые могли бы чувствовать только один запах) (рис. 22.7). Наоборот, если выбор OR связан с обратимым эпигенетическим механизмом, клонированные животные должны демонстрировать картину экспрессии Р2, идентичную той, которую демонстрирует мышь-донор, и нормальный репертуар экспрессии рецептора. Анализ экспрессии обонятельного рецептора показал, что механизм выбора рецептора полностью обратим и не связан с генетическими изменениями, как это видно при созревании В- и Т-клеток (Eggan et al., 2004).
Рис. 22.7. Клонирование ядер зрелых обонятельных нейронов
Мыши, клонированные из зрелых обонятельных нейронов имели нормальный репертуар экспрессии обонятельных рецепторов (ОЮ, в котором лишь 0,1 % нейронов экспрессируют рецептор Р2. — как и у мышей-доноров Экспрессию рецептора Р2 определяли, используя мышей-доноров, имевших ген маркера GFP, вставленный в ген рецептора Р2. Результаты этого опыта показали, что выбор экспрессии рецептора определяется не генетическими изменениями, а обратимым эпигенетическим механизмом
Рак и реверсия злокачественного состояния с помощью трансплантации ядер
Клонирование мышей из терминально дифференцированных лимфоцитов и постмитотических нейронов продемонстрировало, что пересадка ядер дает нам в руки инструмент для избирательного репрограммирования эпигенетического состояния клеточного генома без изменения его генетического состава. Рак вызывается генетическими, а также эпигенетическими изменениями, но влияние эпигенетики на злокачественный фенотип раковой клетки не было определено. Трансплантацию ядер раковых донорских клеток использовали как прямой подход к оценке обратимости трансформированного состояния. Действительно, предыдущие эксперименты с амфибиями показали, что ядра из клеток карциномы почки можно репрограммировать, и они будут поддерживать раннее развитие до стадии головастика (McKinnell, 1962). Аналогичный результат был получен на мышах, где ядра из линии клеток медуллобластомы смогли обусловить, хотя и с низкой эффективностью, раннее развитие, в результате чего были получены эмбрионы с задержкой дальнейшего развития (Li et al., 2003). Однако эти эксперименты не были однозначной демонстрацией того, что эти клоны были получены из раковых клеток, а не из загрязняющих культуру нетрансформированных клеток. Когда ядра целого ряда опухолевых клеток, в том числе клеток лейкемии, лимфомы, рака груди и меланомы, пересадили в денуклеированные мышиные яйцеклетки, большинство из них оказались способными поддерживать предимплатационное развитие до стадии нормально выглядящих бластоцист (Hochedlinger et al., 2004). Следовательно, внутриклеточная среда ооцита смогла подавить злокачественный фенотип этих опухолевых клеток и сделать возможным внешне нормальное раннее развитие. Однако лишь геном от модельной меланомы, индуцированной RAS, дал начало линии клонированных клеток ES, способных дифференцироваться в большинство, если не во все линии соматических клеток в химерных мышах. Тем не менее, из-за генетических изменений, имевшихся в донорских клетках, у всех этих химер развивался рак. Эти результаты показывали, что раковое ядро после взаимодействия с цитоплазмой яйцеклетки обеспечивало дифференцировку всех линий, показывая тем самым, что злокачественный фенотип этих раковых клеток в основном определялся эпигенетическими изменениями. Другой вывод был сделан из экспериментов по клонированию ядер донорских клеток ЕС. В противоположность ядру соматической раковой клетки злокачественный фенотип эмбриональных опухолей был обусловлен генетическими изменениями, поскольку его не удавалось обратить экспозицией с цитоплазмой яйцеклетки (Blelloch et al., 2004).