10.5. Экспериментальное подавление элиминации IES в развивающемся макронуклеусе

Зависящее от гомологии подавление IES у Paramecium

Если делеция или сохранение клеточных генов контролируются путем сравнения содержания соматического генома и генома зародышевой линии, тогда даже эффективная в норме эксцизия IESs могла бы, возможно, нарушаться, когда копии присутствуют в материнском макронуклеусе. Изучение менделевской мутации, mtF^E, обладающей плейотропными влияниями на развитие макронуклеуса, в том числе влиянием на детерминацию типа спаривания (Brygoo and Keller, 1981a,b), дало возможность проверить это предсказание. Оказалось, что эта мутация, будучи в гомозиготном состоянии, отменяет вырезание IES-последовательности, локализованной в гене поверхностного антигена G. Удивительно, но когда аллель дикого типа гена mtF была реинтродуцирована в мутантный штамм в результате конъюгации, эта IES все еще не вырезалась в ходе последующего развития макронуклеуса (Meyer and Keller, 1996). Генетический анализ получившегося в результате вариантного штамма, названного штамм IES⁴, подтвердил, что генетически он является диким типом и что специфическое сохранение этой IES наследуется по материнской линии в половом потомстве (Duharcourt et al., 1995).

Является ли эксцизия IES в развивающихся макронуклеусах индуцированной материнскими копиями корректно перестроенного гена G или же ингибированной материнскими копиями сохраняющего IES гена G?

Чтобы ответить на этот вопрос, макронуклеусы клеток 1ES⁺ или IES были трансформированы с помощью прямой микроинъекции плазмид, содержащих фрагмент кодирующей последовательности G в ее микронуклеарной (IES⁺) или макронуклеарной (IES ) версиях (рис. 7.8) (Duharcourt et al., 1995). После автогамии трансформированные клоны, содержавшие плазмиду IES", дали линии потомков, которые сохранили IES в своих вновь сформировавшихся макронуклеусах, тогда как клетки IES⁺, трансформированные плазмидой IES", оказались неспособными индуцировать эксцизию, и их потомство оставалось в состоянии IES⁺. Плазмида, содержавшая только IES, без каких-либо фланкирующих последовательностей, также вызывала сохранение IES, показывая тем самым, что одни только материнские копии IES подавляют эксцизию из материнских макронуклеусов (Duharcourt et al., 1995).

«Матерински контролируемые» versus «не матерински контролируемые» IESs у Paramecium

Может ли вырезание других IESs контролироваться подобными материнскими влияниями? Для ответа на этот вопрос макронуклеусы клеток дикого типа трансформировали большими сегментами микронуклеарной ДНК (IES⁺), содержащими гены поверхностных антигенов либо G, либо A (Duharcourt et al., 1998). Эти инъецированные сегменты содержали, соответственно, шесть и девять IESs. Изучали эксцизию 13 из этих IESs, и оказалось, что пять IESs сохранялись в макронуклеусах поставтогамных потомков этих трансформированных клеток. Инъекция плазмид, содержащих одиночные IESs, показала, что подавление было строго специфичным: каждая из этих пять IESs индуцировала сохранение только гомологичной зиготической IES, но не влияла на какие-либо другие. Контрольный фрагмент ДНК, содержавший большую часть макронуклеарного (IES) гена (7, не оказывал никакого влияния на любую из тестируемых IESs. Среди 13 испытанных IESs Paramecium не было сколько-нибудь очевидных различий в величине, составе оснований или в положении внутри генов между этими пятью, которые продемонстрировали материнский эффект, и восьмью, которые его не обнаружили (Duharcourt et al., 1998).

Зависящее от гомологии подавление элиминации IES у Tetrahymena

Эксперименты, аналогичные проведенным на Paramecium, показали, что содержание ДНК родительского макронуклеуса Tetrahymena может регулировать элиминацию гомологичных последовательностей из развивающегося соматического генома Две хорошо охарактеризованные IESs, делеционные элементы М и R, были введены путем микроинъекций в макронуклеусы штаммов дикого типа таким образом, что они поддерживались на высококопийных векторах. Когда у этих клеток была индуцирована конъюгация, потомство клеток, содержащих материнские копии элемента М, оказалось неспособным эффективно элиминировать соответствующие IESs во время развития макронуклеуса (Chalker and

Yao, 1996). Подобным же образом клетки, родительские макронуклеусы которых содержали копии элемента R, оказались неспособными вырезать гомологичную IES. Существенное подавление эксцизии негомологичных элементов не наблюдали. Таким образом, подавление элиминации ДНК было специфичным в отношении последовательности. Последовательности, гомологичные самой IES, были достаточны для этого подавления, а непосредственно фланкирующие ДНК таким эффектом не обладали. Важно отметить, что эта индуцированная неспособность к элиминации ДНК была наследуемой, поскольку последующие поколения также сохраняли геномные копии этой IES в своих макронуклеусах.

Поскольку у Tetrahymena в конъюгирующих парах во время развития происходит интенсивный обмен цитоплазмой, исследователи имели возможность наблюдать, что это подавление передавалось через цитоплазму таким образом, что лишь один из партнеров должен был нести эту IES в своем родительском соматическом геноме для того, чтобы были затронуты гомологичные последовательности во всех развивающихся ядрах в паре, включая ядра в партнере дикого типа. Следовательно, состояние перестройки ДНК, характерное для родительских ядер, передается через цитоплазму и регулирует события, происходящие во время формирования нового соматического генома следующего поколения. Никакого обмена ядрами зародышевой линии не требуется для передачи состояния одного партнера по спариванию другому; это наблюдение исключает возможность того, что передача происходит путем наложения импринта на зародышевую линию в ходе нормального клеточного роста до вступления в развитие (Chalker et al., 2005). Действительно, путем физического разделения конъюгирующих пар, состоящих из клетки дикого типа и ее партнера, содержавшего копии элемента М в своем материнском соматическом ядре, было показано, что передача происходит после мейоза и очень близко к тому моменту, когда развивающиеся ядра впервые начинают дифференцироваться в новые макронуклеусы и микронуклеусы. Следовательно, влияние материнского соматического генома активно устанавливается в ходе развития.

Биологические следствия материнского контроля

Способность инфузорий изменять перестройки ДНК таким образом, чтобы отражать материнский паттерн, дает клеткам простой способ передавать альтернативные соматические версии генома половому потомству. Эта динамическая регуляция означает, что стабильное равновесие между двумя альтернативными генетическими состояниями, например IES⁺(100 % эксцизии) и IES(0 % эксцизии) может достигаться и поддерживаться на протяжении многих половых поколений. Это было показано по крайней мере для одной IES Paramecium, для которой такое материнское влияние достаточно для того, чтобы превратить меньшую долю макронуклеарных копий IES⁺ в большую фракцию в макронуклеусе следующего поколения (Duharcourt et al., 1995). Такое влияние параллельно стабильному, материнскому наследованию типов спаривания О и Еу P.tetraurelia. Сопоставимая асимметрия обнаруживается в обеих системах, потому что и эксцизия IES, и детерминация О-типа, по-видимому, являются путями развития «по умолчанию», тогда как и сохранение IES, и детерминация Е-типа нуждаются в некоем цитоплазматическом сигнале из материнского макронуклеуса для изменения этих своих путей развития. Эти системы вполне могут быть родственными, потому что менделевская мутация mtF^E, нарушающая эксцизию одной IES гена G независимо от родительского состояния, сходным образом делает детерминацию к Е конститутивной — наблюдение, связывающее альтернативные состояния обоих примеров. Выяснение механизма (механизмов), лежащего в основе этих явлений, несомненно вскроет новые способы материнского наследования эпигенетической информации.

^{Рис. 7.8. Зависимое от гомологии подавление эксцизии IES материнским макронуклеусом}

^{В ходе нормального развития IESs (красные и зеленые прямоугольники) эффективно вырезаются. Однако трансформация материнского макронуклеуса данной IES (исходные трансформанты = поколение t) может подавить элиминацию гомологичной IES во время последующих (поколение t + 1) (b будущих) раундов дифференцировки нового макронуклеуса}