1. Обзор RNAi-пути

Хотя термин «RNAi» первоначально использовался для описания сайленсинга, который опосредуется экзогенной dsRNA у С. elegans (Fire et al., 1998), сейчас он в широком плане обозначает сайленсинг генов, включаемый dsRNA того или иного рода. Этапы RNAi включают образование dsRNA (которая может быть эндогенной или экзогенной, как, например, вирусная РНК), её процессинг в siRNA и «нацеливание» этих молекул либо на hRNAs (PTGS), либо на участки хроматина (TGS), чтобы вызвать сайленсинг. Поэтому, прежде чем представить компоненты механизма RNAi, специфичные для TGS, мы обсудим источник dsRNA, запускающих механизм RNAi.

dsRNA могут образовываться в результате двунаправленной транскрипции повторяющихся элементов ДНК или транскрипции молекул РНК, спсобных к спариванию оснований внутри себя с образованием сегментов dsRNA (рис. 8.1, а и б, соответственно) Например, транскрипция с участков инвертированных повторов дает молекулы РНК, складывающиеся сами на себя с образованием шпилечных структур. Затем dsRNA расщепляются ферментом Dicer — рибонуклеазой класса RNase III, которая генерирует siRNAs. siRNAs — это комплементарные дуплексы величиной 21—27 нуклеотидов, обладающие характерным «свисающим концом» [overhang] длиной 2 нуклеотида на каждом 3’-конце дуплекса (Hamilton and Baulcombe, 1999; Zamore et al., 2000; Bernstein et al., 2001; Elbashir et al., 2001: Hannon. 2002; Zamore, 2002; Bartel, 2004; Baulcombe, 2004). Эти дуплексы раскручиваются в однонитевые siRNAs, которые действуют как «проводники», взаимодействуя на основе спаривания оснований с комплементарными последовательностями-мишенями. Они являются, следовательно, факторами специфичности и играют центральную роль во всех механизмах сайленсинга, опосредованных RNAi.

На данный момент идентифицированы два родственных комплекса, включающие siRNA: RISC и RITS. В комплексе RISC (RNA-Induced Silencing Complex) siRNAs распознают nRNAs-«мишени» и инициируют их деградацию путем эндонуклеолитического расщепления в пределах участка nRNA, спаренного с siRNA (Hannon, 2002; Bartel, 2004). Этот первоначальный акт расщепления выполняет PHКаза-Н-домен белка семейства Argonaute/PIWI (субъединица RISC). В ядерном комплексе RITS (RNA-Induced Transcriptional Silencing), сходном с RISC, siRNAs «нацеливают» этот комплекс на хромосомные участки для модификации хроматина (Verdel et al., 2004; Buhler et al., 2006). Это и есть RITS-опосредованный РНК-путь — центральная тема этой главы.

^{Рис. 8.1. Источники dsRNA, являющихся субстратом для образования siRNAs рибонуклеазой Dicer и триггером РНК-сайленсинга}

^{(а) У S. pombe двунаправленную транскрипцию наблюдали в центромерных районах и районе cenH «молчащего» локуса типа спаривания. (б) Транскрипция инвертированных повторов, обнаруживаемых в клетках многих растений и животных, потенциально может производить dsRNA. (в) Транскрипция аберрантных РНК, которые могут не иметь соответствующих сигналов процессинга, может включать синтез dsRNA с помощью RdRPs}

Для механизма РНК-сайленсинга дополнительного типа с участием микроРНК (miRNA) требуются ключевые белки Argonaute и Dicer. HYR, транскрибированная с эндогенных некодирующих генов и исходно образующая шпилечные РНК-структуры благодаря растянутым dsRNA-участкам, в несколько этапов процессируется в miRNA (Bartel, 2004; Filipowiicz et al., 2005). Подобно siRNAs, miRNAs имеют размеры 21—24 нуклеотида и образуют часть RISC через посредство белков Argonaute для «нацеливания» на специфические иРНК. Результатом этого «нацеливания» может быть расщепление посредством PIWI/RNaseH-домена и репрессия трансляции, включая взаимодействия с кэпом 7meG на 5’-конце иРНК. Это может сочетаться с секвестрированием иРНК в цитоплазматических РНК-процессирующих органеллах, известных как Р-тельца (Processing bodies). Таким образом, к образованию siRNA или miRNA приводят по крайней мере два разных пути процессинга dsRNA; тем не менее, эти РНК используют сходные средства для инактивации сходных иРНК. Путь miRNA отличается, поскольку все miRNAs производятся эндогенными некодирующими генами, которые в основном регулируются процессами развития и, в свою очередь, обычно «нацеливают» и регулируют в развитии сайленсинг гомологичных генов.

Хотя dsRNAs могут образовываться путем отжига прямонаправленной и инверсной РНК, получающихся в результате двунаправленной транскрипции, или присутствуют в виде шпилечных структур, в некоторых клетках для RNAi требуется дополнительный энзим для образования dsRNA. Этот фермент — РНК-направляемая РНК-полимераза (RdRP), обнаруженная у растений и у С. elegans (Dalmay et al., 2000; Sijen et al., 2001). Он использует siRNAs в качестве праймеров для генерации большого количества dsRNA, которые затем могут процессироваться Dicer в дополнительные siRNA. Таким образом, считается, что первичная функция RdRP — амплификация RNAi-ответа, но, как мы обсудим позже, RdRP может играть и более специфическую роль в инициации синтеза dsRNA (раздел 5). Действительно, она, по-видимому, участвует в процессе, приспособленном для формирования лучшей защитной реакции хозяина в ответ на введение экзогенной dsRNA. Эта идея подкрепляется тем фактом, что RdRPs не являются участниками путей сайленсинга с помощью miRNA (Sijen et al., 2001). Интересно, что в геномах насекомых (в том числе Drosophila) и позвоночных (включая млекопитающих) отсутствуют распознаваемые RdRP-подобные последовательности, но остается возможность, что у этих организмов синтез dsRNA выполняют другие полимеразы.

Какова же тогда функция этих разнообразных механизмов РНК-сайленсинга? Они весьма консервативны у широкого круга организмов, от дробянковых дрожжей и растений до человека, и они играют центральные роли в регуляции экспрессии генов и стабильности генома (через формирование стабильного гетерохроматина в центромерах и теломерах). Кроме того, эти механизмы сайленсинга принимают участие в защите против транспозонов и РНК-вирусов путем разрушения их РНК-транскриптов (Plasterk, 2002; Li and Ding, 2005). Наконец, транскрипция с некоторых транспозонов приводит к образованию аберрантных РНК, включающих RNAi с помощью механизма, конвертирующего, как полагают, аберрантные транскрипты в dsRNA с помощью RdRPs (рис. 8.1) (Baulcombe, 2004).