3.3. Необычный состав центромерного хроматина
Данные об эпигенетическом регулировании центромерной идентичности и воспроизведении указывают на вероятность того, что ключевыми детерминантами являются структура и состав хроматина, а не первичные последовательности ДНК. Здесь мы обсудим различные компоненты и структуры, обнаруживаемые в хроматине CEN, а также удивительное наблюдение, показывающее, что эти свойства консервативны у далеко отстоящих друг от друга эукариот.
Рис. 14.5. Формирование неоцентромер у человека и мух (а)
Хромосомы человека, несущие неоцентромеры, которые демонстрируют центромерную функцию и формирование кинтетохора в отсутствие центромерной ДНК, обычно связаны с крупными перестройками (Amor and Choo, 2002). В этом примере происходящая от хромосомы 10 неоцентромера (mar(del)10), структура которой указывает на формирование посредством большой интерстициальной делеции. удалившей эндогенную центромеру (серые пунктирные линии). Mar(del) 10 была открыта у индивидуума, в кариотипе которого была также кольцевая хромосома (ring(del)10, не показана), содержавшая ДНК из делегированного участка Последовательность событий для неоцентромер человека неясна; формирование неоцентромеры могло бы происходить вначале, давая дицентрическую хромосому, которая впоследствии подвергается перестройкам, или же формирование неоцентромеры могло бы происходить после делеции эндогенной центромеры, (б) У мух неоцентромеры могут создаваться экспериментально из минихромосомы, охарактеризованной на молекулярном уровне. Фрагмент эухроматина величиной 320 т.п.н. и теломерный хроматин, не содержащий центромерной ДНК. можно отделить от остальной минихромосомы, используя облучение. Этот фрагмент, который должен бы быть «ацентрическим», может стать функциональной неоцентромерой, которая надежно воспроизводится в митозе и мейозе и содержит белки центромеры и кинетохора, в норме ограниченные эндогенной центромерой (Blower and Karpen, 2001). Однако для формирования неоцентромеры требуется близость к эндогенной неоцентромере (420 т.п.н.), как в инверсионном деривате ?238; более того, формирование неоцентромеры не происходит по обе стороны от центромеры, когда присутствует перицентрический гетерохроматин (Maggert and Karpen, 2001) Эти результаты заставляют предполагать, что формирование неоцентромеры происходит через эпигенетическое распространение центромерного хроматина в соседний эухроматин, за которым следует эпигенетическое воспроизведение центромерной идентичности и функции. Блокирование этого процесса гетерохроматином согласуется с наблюдением, что сверхэкспрессированная CENP-A включается эктопически в эухроматин. но не в гетерохроматин (Heun et al. 2006), и позволяет предполагать, что протяженность центромерного хроматина определяется двумя эпигенетическими процессами: загрузкой и распространением CENP-A и формированием — блокированием гетерохроматина
У всех эукариот в центромерных нуклеосомах присутствуют специфичные для центромер белки семейства CENP-A, подобные гистону H3 (рис. 14.6а). Они служат и структурной, и функциональной основой для кинетохора и являются превосходными кандидатами на роль эпигенетической метки, устанавливающей и воспроизводящей центромерную идентичность (Cleveland et al., 2003). В отличие от большинства белков кинетохоров, собирающихся во время митоза, CENP-A присутствует в центромерах на протяжении всего клеточного цикла, что является одним из первых указаний на его важность для центромерной идентичности. У дрожжей, червей, мух и млекопитающих хроматин, содержащий CENP-A, обеспечивает также основу, существенную для рекрутирования белков кинетохора, прикрепления веретена и нормального расхождения хромосом (Carroll and Straight, 2006). Эксперименты по реципрокному эпистазу показали, что CENP-A является первым белком на пути сборки кинетохора, что согласуется с его физической локализацией в хроматине в основании кинетохора в митотических хромосомах. Дальнейшие доказательства важности CENP-A для формирования кинетохора вытекают из опытов по сверхэкспрессии у мух, в которых неправильная локализация CENP-A в нецентромерных районах производит функциональные эктопические кинетохоры (Heun et al., 2006). Поэтому, коль скоро этот вариант гистона существен для центромерной функции, мы в настоящее время определяем CEN-хроматин как район ДНК и белков, связанных с CENP-A.
Структура нуклеосом, содержащих CENP-A. необычна по сравнению с каноническими гистоновыми корами, содержащими H3, Н2А, Н2В и Н4. Нуклеосомы CENP-A можно собрать in vitro из очищенного
CENP-A и гистонов Н2А, Н2В и Н4, что согласуется с предыдущими наблюдениями, показывающими, что in vivo они гомотипичны (т.е.содержат две копии CENP-А, а не одну копию H3 и одну копию CENP-A) (Yoda et al., 2000). Детальный биофизический анализ показал, что интерфейс между CENP-A и Н4 отличается от интерфейса H3—Н4, и домен, взаимодействующий с Н4 достаточен для «нацеливания» CENP-A на центромеры в присутствии эндогенного CENP-A (Black et al., 2004).
Замещение гистона H3 белком CENP-A в центромерных нуклеосомах первоначально позволяло думать, что CENP-A составляет весь хроматин, связанный с кинетохором. У S. pombe CENP-A равномерно распределен по центральным коровым участкам величиной 5—7 т.п.н. Эти коры фланкируются крупными гетерохроматиновыми доменами, содержащими метилирование H3K9 и белки гетерохроматина (Pidoux and Allshire, 2004). Однако детальный цитологический анализ и исследования с использованием иммунопреципитации обнаружили, что у многоклеточных эукариот центромерный хроматин имеет более сложный состав и организацию. Центромеры Drosophila, человека и риса содержат перемежающиеся блоки нуклеосом, содержащих H3 и CENP-A (в совокупности называемые CEN-хроматином), фланкированные еще более крупными блоками (от тысяч до миллионов пар нуклеотидов) перицентромерного гетерохроматина (рис. 14.66) (Blower et al., 2002; Yan et al., 2005).
Рис. 14.6. Организация центромерного хроматина
(a) CENP-A является высококонсервативным, специфичным для центромер вариантом гистона Рисунок показывает его локализацию исключительно в центромерах в митотических хромосомах Drosophila (б) CEN-хроматин у мух и человека содержит перемежающиеся блоки содержащих Н3 и содержащих CENP-A нуклеосом и фланкирован перицентромерным гетерохроматином (Blower et al. 2002)
Чередование [interspersion] доменов H3 и CENP-A ставит ключевые вопросы относительно эпигенетической природы CEN-хроматина. В частности, модифицированы ли субдомены H3 в CEN-хроматине многоклеточных эукариот подобно гетерохроматину или эухроматину? Или же они маркированы уникальным образом? Далее, эквивалентна ли каждая перемежающаяся единица CENP-A/H3 в более крупных эукариотических центромерах единичной центромере S. pombe? К этим вопросам обратились, изучая посттрансляционные модификации, характеризующие перемежающиеся блоки нуклеосом H3 и CENP-A и обнаружившие еще большую сложность. Удивительно, что у человека и мух перемежающиеся домены H3 содержат H3K9me2 — метку, обычно ассоциированную с эухроматином — и, более того, не имеют H3K9me2 и H3K9me3, ассоциированных с фланкирующим гетерохроматином (рис. 14.7а) (Sullivan and Karpen, 2004; Lam et al., 2006). Однако, как и в гетерохроматине, в перемежающихся нуклеосомах H3 отсутствовали множественные формы ацетилирования H3 и Н4, как отсутствовал и H3K4me3. Таким образом, нуклеосомы H3 в CEN-хроматине обнаруживают паттерн модификаций, отличающийся от канонических эухроматина или гетерохроматина (рис. 14.76). Эти результаты наводят также на мысль, что центросомы мух и человека не составлены просто из повторяющихся S. pombe-подобных центромер. Важно, однако, отметить, что общая организация центромерных районов консервативна, так что у всех многоклеточных эукариот и у S. pombe весь хроматиновый домен CENP-A фланкируется перицентромерным гетерохроматином, содержащим метилирование H3K9.
Какова возможная функциональная роль модификаций гистонов в CEN и фланкирующем хроматине? Отдельные состояния хроматина в районе CEN, вероятно, вносят вклад в разнообразные свойства центромерных доменов, такие как установление сроков для дифференциальной репликации CEN и фланкирующего гетерохроматина (Sullivan and Karpen, 2001; Blower et al., 2002). Модификации фланкирующего перицентромерного гетерохроматина могут также поддерживать размеры центромер, создавая барьер против расширения CEN-хроматина. У Drosophila CEN-хроматин легко распространяется на соседние последовательности, когда фланкирующий гетерохроматин удаляется, делая возможной активацию неоцентромеры (рис. 14.56) (Maggert and Karpen, 2001), а сверхэкспрессия CENP-A приводит к неправильной локализации в эухроматин, но не гетерохроматин (Heun et al., 2006). Интересно, что результатом сверхэкспрессии CENP-A в клетках человека является распространение CEN -хроматина и изменения в метилировании H3K9 во фланкирующих участках (Lam et al, 2006). Таким образом, размеры центромер, по-видимому, определяются балансом между двумя эпигенетическими состояниями: CEN-хроматином и фланкирующим перицентромерным гетерохроматином.
Концентрация белков, необходимых для сцепления (когезии) сестринских хроматид, которое устанавливается одновременно с репликацией ДНК в фазе S, выше всего в гетерохроматине, фланкирующем центромеру. Это распределение, по-видимому, вносит вклад в соответствующую двойную ориентацию кинетохоров в митозе, а также в поддержание сцепления во время метафазы несмотря на развиваемые веретеном силы, концентрирующиеся в кинетохорах/центромерах (Watanabe, 2005). Эпигенетическое регулирование сцепления включает рекрутирование когезинов белками НР1 (Swi6у S. pombe), которое, в свою очередь, опосредуется высокими концентрациями метилирования H3K9 в перицентромерном гетерохроматине (Nonaka et al., 2002). Таким образом, специфичные для CEN комбинации модификаций гистонов тоже могли бы быть важными для рекрутирования когезионных комплексов к гетерохроматину вблизи сестринских кинетохоров, обеспечивая в то же время пространственное разделение когезионных и кинетохорных доменов (Sullivan and Karpen, 2004; см. также главу 6).
Рис. 14.7. Различные паттерны модификаций гистонов в центромерном хроматине
(а) Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител, распознающих специфические модификации гистонов на расправленных хромосомных фибриллах, показал, что перемежающиеся блоки нуклеосом, содержащих H3, обладают паттерном модификаций, отличающимся от канонических эухроматина и гетерохроматина (Sullivan and Karpen, 2004). Например, несмотря на то, что центромеры у большинства эукариот погружены в крупные блоки перицентрического гетерохроматина, перемежающиеся блоки H3 содержат модификацию H3K9me2, в норме ассоциирующуюся с «открытым» эухроматином (наверху) и лишены гетерохроматинового маркера H3K9me2, присутствующей в перицентрических фланкирующих участках (внизу), (б) Сводка «двумерной» организации центромерного хроматина в интерфазе, основывающаяся на исследованиях растянутых фибрилл хроматина у мух и человека. + и — обозначают присутствие и отсутствие указанных модификаций гистонов (соответственно) в эухроматине, перицентромерном гетерохроматине и перемежающихся блоках нуклеосом H3 в центромерном хроматине (Sullivan and Karpen 2004; Lam et al., 2006). (в) Модель трехмерной организации хроматина в центромерном районе митотических хромосом. Предполагается, что ассоциации между сходным образом модифицированными нуклеосомами вносят вклад в формирование отдельных трехмерных структур в центромерном и фланкирующем хроматине. Перемежающиеся CENP-A/ CID и по-разному модифицированные H3 и Н4 могут опосредовать формирование «цилиндрических» трехмерных структур, наблюдаемых в метафазных хромосомах (Blower et al., 2002; Sullivan and Karpen, 2004). Хроматин H3K9me2, рекрутирующий такие белки гетерохроматина, как НР1, и такие белки когезии, как RAD21/SCC1, присутствует во внутреннем кинетохорном пространстве между митотическими сестринскими хроматидами и в участках, фланкирующих центромерный хроматин. Это расположение может быть необходимо для «презентации» CENP-A направленной к полюсу поверхности митотической хромосомы и облегчения рекрутирования внешних кинетохорных белков, а также для стимуляции взаимодействия НР1 с самим собой и правильной конденсации/когезии хромосом. Когезины изображены в виде кольцевидных структур в соответствии с последними моделями
В митотических хромосомах человека и Drosophila субдомены CENP-A сливаются, образуя трехмерную цилиндрическую структуру, в значительной мере исключающую нуклеосомы H3 (Blower et al., 2002). Блоки нуклеосом CENP-A ориентированы на поверхности хромосом, направленной к полюсам, а блоки нуклеосом H3 локализованы по направлению к внутреннему району хроматид. Внутренние и внешние белки кинетохора обернуты вокруг цилиндра CENP-A; это трехмерное расположение согласуется с CENP-A, играющим центральную роль в рекрутировании других кинетохорных белков (Blower et al., 2002). Для того чтобы согласовать двумерное чередование блоков CENP-Аи H3 (рис. 14.66 и 14.76) с разделением в трехмерных митотических хромосомах, предположили, что CEN-ДНК может закручиваться спиралью или выпетливаться в цилиндрической структуре, приводя к выравниванию нуклеосом с одним и тем же составом по одной линии [alignment] или в стопку (рис. 14.7в). Таким образом, раздельно модифицированные перемежающиеся нуклеосомы H3 и фланкирующий гетерохроматин могли бы отвечать за сборку трехмерной структуры CEN-хроматина в митозе (Sullivan and Karpen, 2004). Такое расположение может быть необходимо, чтобы экспонировать хроматин CENP-A внешней стороне хромосомы, где он может рекрутировать кинетохорные белки таким образом, который устанавливает правильную двойную ориентацию сестринских кинетохоров по отношению к полюсам веретена.