3.2. «Нацеливание» PRC1 на сайленсированные гены

Трансгенный анализ кластеров гомеотических генов у Drosophila обнаружил регуляторные элементы, необходимые для поддержания сегмент-специфичной экспрессии генов НОХ. Эти ДНК-элементы — названные Polycomb Response Elements, или PREs — поддерживают сегмент-специфичную экспрессию генов НОХ за рамками фазы эмбриональной инициации. PREs привлекают белки PRC1, будучи интегрированы в эктопические сайты в политенных хромосомах; это позволяет предполагать что они определяют специфичность последовательности для узнавания комплексом PRC1 генов-мишеней и заякоривания на них. Однако тема «нацеливания» PcG оказывается довольно сложной. Размеры функционально охарактеризованных PREs варьируют от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований, они содержат консенсусные сайты связывания для многих разных белков, связывающихся с ДНК, и обычно в данном локусе-мишени обнаруживаются два или более PREs. Все охарактеризованные до сих пор PREs происходят от Drosophila и ни один PRE пока еще не был определен у млекопитающих или растений. Несмотря на сложность PREs, удалось идентифицировать четыре консенсусные последовательности-мотива и показать, что они играют роль в функции PRE у Drosophila. Один из этих мотивов (GCCAT) связывается как с Плейогомеотическими (РНО, Pleiohomeotic), так и с Плейогомеотикоподобными (PHOL) белками, которые обладают отчасти избыточными функциями. РНО и PHOL функционируют в «нацеливании» PcG, поскольку они найдены в комплексах PcG, выделенных из экстрактов ранних эмбрионов, обнаруживают совместную иммунопреципитацию с членами как PRC 1, так и PRC2 и связываются с PREs in vitro (рис. 11.5а) (Poux et al., 2001). Недавно значение в рекрутировании PcG было продемонстрировано и для DSP1, который связывается с мотивом GAAA, обнаруженным во многих PREs (Dejardin et al., 2005). Наконец, белки trxG, Zeste и GAF (кодируемый геном Trithorax-like) могут помогать рекрутировать белки PcG к их мишеням.

Вновь разработанный алгоритм, основывающийся на том, что собранные в кластер пары сайтов GAF, Zeste и PHO/PHOL характеризуют PRE, с высокой вероятностью предсказывает известные PREs и, таким образом, может идентифицировать потенциальные гены-мишени PcG в геноме Drosophila (рис. 11.66) (Ringrose et al., 2003). Семейство генов, контролируемых PRE, включает элементы от генов хорошо известных и важных для развития транскрипционных факторов, необходимых для формирования паттерна, до генов, кодирующих факторы, участвующие в регулировании клеточного цикла и старения.

^{Рис. 11.7. Регуляция и функция PRC 1 входе клеточного деления}

^{(а) Кросс-регуляторные взаимодействия между генами PcG, предполагаемые на основе генетических данных. Е(Рс), Pci и Asx — позитивные регуляторы членов кора PRC1, действующих «вверх по течению», Члены PRC2 Esc и E(z) действуют как позитивные регуляторы транскрипции Рс. Видна отрицательная обратная связь от членов кора PRC1 на Psc и dRing 1, а также на Su(z)2. Тонкая настройка уровня генного продукта, вероятно, необходима для хорошо сбалансированных процессов, базирующихся на химическом равновесии, (б) Факторы транскрипции, специфичные для нуклеотидной последовательности (TF) привязывают компоненты PRC1 к PRE. Стабильный сайленсирующий комплекс требует заякоривания PRC1 через хромодомен РС на соседних метилированных «хвостах» гистонов. (в) Возможная модель того, как могут наследоваться состояния дифференциальной экспрессии генов. Процесс межгенной транскрипции помещает позитивные эпигенетические метки (например, ацетилированные хвосты гистонов, варианты гистонов) в PREs, которые контролируют активные гены (PRE 2). Все другие PREs сайленсируются «по умолчанию» (PRE 1). Во время репликации ДНК и митоза только позитивный эпигенетический сигнал нужно передать дочерним клеткам, что гарантирует, что в следующей интерфазе межгенная транскрипция возобновляется в PRE 2, прежде чем сайленсинг «по умолчанию» вновь устанавливается во всех других PREs (а — из Ali and Bender, 2004, переработано)}

PRC1, будучи однажды связанным, взаимодействует с соседними гистонами и генерирует стабильные сайленсирующие комплексы в PREs (Рис. 11.76). Метки H3K27шеЗ, созданные PRC2, действуют как дополнительные места связывания для хромодомена РС (рис. 11.7в). В их отсутствие, как показывает конкуренция с растворимым пептидом метилированного «хвоста» гистона, PRCls диссоциируют со своих генов-мишеней (Czermin et al., 2002; Ringrose et al., 2004; Wang et al., 2004) Открытие у PRC2 активности HKMT и ассоциированных гистоновых меток, типичных для «молчащего» хроматина, позволило предположить новый механизм для установления репрессии PcG. Вслед за катализируемой PRC2 модификацией H3K27me3 PRC1 связывается через хромодомен белка РС и стабилизирует сайленсинг. Это подкрепляется данными о том, что (1) метки H3K27me3 и РС колокализуются на политенных хромосомах и (2) связывание РС утрачивается у мутантов E(z), у которых нет активности HKMT модифицирующей H3 метками H3K27me3 в PREs, помогая рекрутировать РС к его мишеням (рис. L 1.5). Хотя такая модель несомненно привлекательна, ситуация в PRE», по-видимому, более сложная, поскольку PRC2s и PRC1 действуют не последовательно, а, скорее, присутствуют вместе на PREs в раннем эмбриогенезе (рис. 11.56, в). Таким образом, представляется вероятным, что метилирование H3K27 является событием «вниз по течению» после рекрутирования PcG, но играет ключевую роль в установлении «молчащего» состояния.

Эта описанная выше модель демонстрирует параллели с формированием гетерохроматина, где Гетерохроматиновый Белок 1 (НР1) рекрутируется через свой хромодомен к меткам H3K9me, созданным SU(VAR)3-9 (глава 5). Таким образом, продуктивный сайленсирующий комплекс «нацеливается» транскрипционными факторами на определенные элементы нуклеотидных последовательностей ДНК, но, помимо этого, требует поблизости слой соответствующим образом модифицированных гистонов для генерации структуры репрессированного хроматина более высокого порядка (рис. 11.5).

В ходе эволюции PREs оказались на удивление мало консервативными по последовательности. Даже в пределах близкородственных видов Drosophila число, положение и состав PREs существенно варьируют (L. Ringrose and R. Раю, неопубликовано). Это заставляет предполагать, что требования в отношении последовательности, а также положения PREs являются нежесткими и могут быть адаптированными к видоспецифичным требованиям. Тем не менее, компоненты PRC1 высоко консервативны и предположительно используют тот же самый базовый молекулярный механизм (механизмы) для индукции изменений более высокого порядка в хроматине «молчащих» генов-мишеней.