5. Эпигенетический сайленсинг генов и его роль в эволюции рака - значение для ранних стадий развития опухоли
Согласно классическому взгляду на развитие рака, сформулированному Фогелыитейном и его коллегами (Kinzler and Vogelstein, 1997), серия генетических изменений стимулирует продвижение от ранних предмалигнизованных стадий через появление инвазивного рака к началу метастазирующей стадии заболевания (рис. 24.4). Это развитие у разных опухолей не обязательно всегда осуществляется именно в таком порядке Мы знаем, что на всем протяжении такого хода событий, также имеют место эпигенетические изменения: наблюдается раннее появление как широко распространенных утрат нормального метилирования ДНК, так и его более локального прироста в промоторах генов, которые мы обсуждаем. Таким образом, имеется потенциальная возможность для взаимодействия эпигенетических и генетических событий, чтобы направлять последовательные клеточные аномалии на всем протяжении неопластической прогрессии. В соответствии с этим сценарием, данные, касающиеся двух эпигенетических аспектов — потери импринтинга (LOI — loss of imprinting) (как это обсуждалось в главе 23) и сайленсинга генов — оказываются крайне важными для ранних стадий развития рака.
Рис. 24.4. Ранняя роль аномального метилирования ДНК в развитии опухоли
Описано в класической модели (Kinzler and Vogelstein, 1997) генетических изменений в процессе эволюции рака толстой кишки. Показано, что измененное метилирование ДНК имеет место очень рано (красная стрелка), как сказано в тексте, во время превращения нормального эпителия в гиперпластический. Этот факт определяет его стратегическое положение (левая нижняя черная стрелка и левый нижний прямоугольник): стволовые клетки направляются на путь аномальной клональной экспансии (рис. 24.5) при содействии ключевых генетических изменений. Эти эпигенетические аномалии также имеют смысл маркеров, как показано в нижнем левом черном прямоугольнике. Аномальное метилирование ДНК продолжает накапливаться в процессе превращения опухолей из неинвазивных в инвазивные и, наконец, метастазирующие (правая нижняя стрелка и правый прямоугольник). Это создает дополнительную основу для лечения рака и для поисков маркеров, используемых в прогнозировании заболевания
Потеря импринтинга включает в себя процесс, при котором «молчащая» аллель импринтированных генов активируется во время канцерогенеза таким образом, что устанавливается двуаллельная экспрессия гена и избыток продукта данного гена (Rainier et al., 1993). Наиболее изученный пример касается гена IGF2 в таких опухолях, как рак толстой кишки (Kaneda and Feinberg, 2005). В этом случае гиперметилирование промотора в импринтированном гене Н19 на краю хромосомы является результатом сложного процесса контролирования хроматина (глава 19), чтобы аномально активировать «молчащую» аллель 7GF2 (Kaneda and Feinberg, 2005). Получающяяся в результате двуаллельная экспрессия IGF2 приводит к переизбытку белка TGF2, стимулирующего рост. Экспериментальные свидетельства предполагают, что это может играть роль на очень ранних стадиях образования рака толстой кишки (Kaneda and Feinberg, 2005; Sakatani et al., 2005). И действительно, недавние исследования на мышиных моделях предполагают, что сама по себе LOI может быть достаточна, чтобы инициировать процесс опухолеобразования (Holmetal., 2005).
Второй обычный неопластический переход — эпигенетический сайленсинг генов — происходит на ранних фазах неопластического развития. Это очень тесно связано с вопросами о роли клеточного стресса и экспозиции в развитии болезненных состояний. Часто оказывается, что гены, участвующие в процессе, устанавливают те стадии, на которых клетки, подвергнутые стрессу, выживают при повреждении ДНК и(или) хронических нарушениях, увеличиваются, как клон стволовых или прогениторных клеток и затем делаются предрасположенными к более поздним генетическим и эпигенетическим событиям, чтобы осуществить развитие опухоли (рис. 24.5). Первое свидетельство такого участия исходит из данных по нескольким классичесим генам-супрессорам опухоли, которые могут быть либо мутантными, либо эпигенетически сайленсированными в раковых опухолях человека. Например, эпигенетический сайленсинг гена pl6nk4aочень рано осуществляется в популяциях предмалигнизованных клеток, во время начальных изменений, которые предваряют образование опухолей, таких, например, как рак легких (Belinsky et al., 1998), а также в маленьких популяциях гиперпластических эпителиальных клеток нормальных во всем остальном молочных желез некоторых женщин (Hoist et al., 2003). В эксперименте, когда нормальные человеческие клетки эпителия молочной железы выращиваются в культуре (на пластике), этот тип сайленсинга р16 является предпосылкой для самых начальных этапов трансформации клеток (Kiyono et al., 1998; Romanov et al., 2001). Такая потеря функции гена сопровождает неспособность групп клеток молочной железы достичь точки смертности и, по мере того, как эти клетки продолжают пролиферировать, в них развиваются усиливающиеся хромосомные аномалии и экспрессия теломеразы.
Второй пример касается MLHL гена, устраняющего неправильное спаривание оснований. Этот ген мутирует в зародышевой линии тех семей, члены которых предрасположены к раку толстой кишки, такого типа, при котором имеются множественные генетические изменения; это называется фенотип «микросаттелитной» нестабильности (Liuetal., 1995). Однако, 10—15% пациентов с несемейным раком толстой кишки, также имеют опухоли с таким фенотипом, и в большинстве этих раковых опухолей обнаруживается эпигенетический сайленсинг немутировавшего гена MLH1 (Herman et al., 1998; Veigl et al., 1998). В культуре клеток реэкспрессия этого «молчащего» гена MLH1 вызывает появление вновь функционального белка, который восстанавливает значительную часть поврежденной способности репарировать неправильно спаренные основания (Herman etal., 1998).
Рис. 24.5. События эпигенетического сайленсинга генов и опухолеобразование
Самые ранние этапы опухолеобразования описываются как аномальная клональная экспансия, которая разворачивается при стрессовом воздействии на клеточное обновление. Она вызывается такими факторами, как старение и хронические нарушения, связанные, например, с воспалением. Это как раз те клеточные клоны, в которых могут произойти последующие генетические и эпигенетические события, направляющие развитие опухоли. Такие аномальные эпигенетические события, как аберрантный генный сайленсинг, о котором говорится в данной главе, могли бы быть во многих случаях наиболее ранними наследуемыми причинами, вызывающими аномальную клональную экспансию из компартментов стволовых (или прогениторных) клеток в обновляющейся системе клеток взрослого организма. Сайленсинг генов включается модификациями хроматина, которые репрессируют транскрипцию, а гиперметилирование ДНК этого хроматина служит «надежным запором», чтобы стабилизировать наследуемый сай ленсинг, как сказано в тексте главы. Генный сайленсинг, в свою очередь, нарушает нормальный гомеостаз, удерживая стволовые клетки и прогениторные клетки от того, чтобы должным образом двигаться по пути дифференцировки, существующей в данной системе эпителиальных клеток (верхние клетки все более темного синего цвета) и направляя их (большие красные стрелки) к аномальной клональной экспансии
Совсем недавно было показано, что ген Chfr, регулирующий чекпойнт, который также контролирует еще один тип целостности генома, хромосомную стабильность и плоидность, мутирует в опухолях, но чаще проявляет эпигенетический сайленсинг при раке легких и других видах рака, и, что особенно важно, на ранних стадиях развития рака толстой кишки (Mizuno et al., 2002). Изучение нокаутных мышей выявило роль этого гена, как супрессора опухоли, основываясь на его функции какубиквитинлигазы ЕЗ, которая регулирует Aurora А — ген, контролирующий митоза. Эмбриональные клетки мыши характеризуются хромосомной нестабильностью и предрасположенностью к трансформации.
Поскольку список гиперметилированных генов при раке расширился, ключевые события сайленсинга на ранних стадиях развития опухоли определяются теперь для возможных генов-супрессоров опухоли, у которых имеется лишь история эпигенетических изменений, но не мутаций. Например, сайленсинг гена репарации ДНК 06-MGMT происходит на ранних стадиях развития рака толстой кишки (Esteller et al., 2001а), и эта потеря функции может обусловливать возможность сохранения клетками алкилирующего повреждения по гуанозинам, и, таким образом, предрасположенность к точечным мутациям — заменам G-А. В самом деле, сайленсинг этого гена имеет место в предраковых полипах толстой кишки перед появлением высокой частоты таких мутаций как в гене р53, так и в гене RAS, на более поздних стадиях развития опухоли толстой кишки (Esteller et al., 2001а; Wolf et al., 2001). Аналогично этому, сайленсинг гена GST-Pi имеет место практически при всех предраковых повреждениях, предрасполагающих к раку простаты, подвергая клетки риску окислительного повреждения аденинов (Lee etal., 1994).
Третий тип «молчащих» генов — обнаруженных методом беспорядочного скрининга раковых геномов на эпигенетически сайленсированные гены — также начинает вносить существенный вклад в наше понимание ранней роли генного сайленсинга при раке. Особенно интригующий сценарий был установлен в процессе развития рака толстой кишки: эпигенетическая потеря функции происходит в семействе генов (обнаруженных методом микрочипирования, описанного ранее — Suzuki et al., 2002), которые могут допустить раннюю аномальную активацию пути развития, всегда связанную с возникновением и дальнейшей прогрессией этого заболевания. Транскрипционный сайленсинг генов группы secreted frizzled related protein genes (SFRPs) (Suzuki et al., 2004) удаляет антагонистический сигнал к взаимодействию Wnt-лиганд с их мембранными рецепторами (Finch et al., 1997). Этот сайленсинг коррелирует с Wnt-управляемой апрегуляцией общих уровней ?-катенина в клетке, особенно благодаря повышенному присутствию и увеличенной активности в ядре этого транскрипционного фактора (Suzuki et al., 2004). Такая транскрипция — это каноническое считывание для повышенной активности Wnt-пути (Morin et al., 1997; Gregorieff and Clevers, 2005). Наиболее важным является тот факт, что сайленсинг SFRP происходит в очень ранних повреждениях, которые предрасполагают к раку толстой кишки, прежде чем происходят обычные мутации в белках Wnt-пути «вниз по течению», которые тоже приводят к активации ?-катенина в ядре (Morin et al., 1997; Gregorieff and Clevers, 2005) Таким образом, ранняя активация Wnt пути, обусловленная эпигенетическими событиями, оказывается сбалансированной, чтобы позволить раннее распространение клеток, предрасположенных к тому, чтобы и далее активировать этот путь посредством мутаций. Сохранение как эпигенетических (действующих через Wnt-управляемое увеличение клеточного ?-катенина), так и генетических (действующих через повреждение белкового комплекса, разрушающего ?-катенин. или через активирование Wnt мутаций) изменений, похоже, позволяют им дополнять друг друга при контроле развития заболевания (Suzuki et al., 2004).
Еще один пример из данной группы генов — это HIC-1 (hypermethylated-in-cancer 1). который кодирует транскрипционный репрессор типа «цинкового пальца» HIC-1 был обнаружен методом случайного скрининга на гиперметилированные островки CpG в горячей точке для потери хромосомы в раковых клетках (Wales et al., 1995). Оказалось, что этот ген, который сайленсирует на ранней стадии развития рака, но не мутирует, играет роль гена-супрессора опухоли при использовании модели нокаутной мыши (WY. Chen et al., 2003, 2004). Он служит дополнением к мутациям р53 частично, через потерю функции, которая приводит к апрегуляции SIRT1 (Chen et al., 2005), ключевого белка, воспринимающего клеточный стресс, и участвующего в росте стволовых или прогениторных клеток (Howitz et al., 2003; Nemoto et al., 2004; Kuzmichev et al., 2005).
Таким образом, приведенные выше данные вносят свой вклад в тематические гипотезы, представленные на рис. 24.4. Это предполагает, что некоторые из наиболее ранних наследуемых изменений в развитии опухолей могут представлять собой эпигенетические изменения, которые часто включают в себя жесткий транскрипционный сайленсинг генов, поддерживаемый метилированием промотора ДНК. Сложные задачи по дальнейшему пониманию этих сценариев целиком связаны с ключевыми задачами по изучению эпигенетических изменений при раковых заболеваниях, которые обрисованы в табл. 24.5 и более полно обсуждаются далее. Решение этих задач, в особенности для понимания роли эпигенетических изменений на самых ранних стадиях неопластического формирования, может удивительно обогатить молекулярные стратегии, имеющие целью предотвращение и раннее вмешательство при раковых заболеваниях.
Таблица 24.5. Главные задачи исследований молекулярных событий, связанные с эпигенетическим сайленсингом генов при раке
1. Выяснить связи между одновременным появлением и утратой метилирования ДНК в одних и тех же раковых клетках
2. Определить молекулярную природу границ (и то, как они изменяются при опухолеобразовании), которые отделяют области транскрипционно активных зон от транскрипционно репрессивных областей, окружающих промоторы генов и которые могут препятствовать распространению репрессивного хроматина через активную зону. Роль возможных механизмов могут играть ключевые модификации гистонов, инсуляторные белки, белки, осуществляющие ремоделинг хроматина, и т. д.
3. Определить, какова последовательность событий в эволюции генного сайленсинга при раке, по отношению к модификации гистонов, метилированию ДНК и т. д. Что идет вначале и каковы ключевые белковые комплексы (ферменты метилирования ДНК, ферменты деацетилирования и метилирования гистонов, белки, связывающиеся CpG с метилом, комплексы сайленсинга группы Polycomb и т. д.), которые нацеливают вышеупомянутые процессы, определяющие данные события
4. Какие специфические ферменты, метилирующие ДНК, требуются для инициации и(или) поддержания наиболее стабильного генного сайленсинга, и какие белковые комплексы содержат их. с учетом их взаимодействие с ключевыми компонентами гистонового кода
5. Каковы все компоненты аппарата метилирования ДНК и хроматина и какова иерархия их участия, необходимого для поддержания генного сайленсинга, и насколько обратимы их действия?