4. Малые РНК инициируют сборку гетерохроматина в связи с эффекторным комплексом RNAi

В связи с открытием, что путь RNAi участвует в формировании гетерохроматина у дробянковых дрожжей и в транскрипционном сайленсинге генов в других системах возник вопрос о том. каким образом этот путь может непосредственно регулировать структуру хроматина. Очистка Chp1, хромодоменного белка, являющегося структурным компонентом гетерохроматина, привела к идентификации комплекса RITS (Verdel et al., 2004). RITS, кроме Chp1, содержит белок Ago1, характерный для дробянковых дрожжей, и Tas3, белок с неизвестной функцией. Он также содержит центромерные siRNAs, которые создаются рибонуклеазой Dicer, и, что важно, RITS связывается с районами центромерных повторов зависимым от siRNA образом. Поэтому предположили, что RITS использует центромерные siRNAs для «нацеливания» на специфичные хромосомные районы для инактивации, и это обеспечивает прямую связь между RNAi и сборкой гетерохроматина (рис. 8.4).

^{Рис. 8.3. Сборка гетерохроматина включает совместное действие модифицирующих гистоны энзимов (HDACs и Clr4) и связывающихся с гистонами белков (например, Swi6) и может направляться механизмом КТФш}

^{Деацетилирование HDACs сопровождается рекрутированием Clr4 и метилированием H3K9 гистонов. Swi6 связывается с метилированными по H3K9 «хвостами» гистонов, и в результате последовательных циклов метилирования H3K9, сопряженных с олигомеризацией Swi6, происходит распространение гетерохроматина}

Подобно RISC, опосредующему PTGS, RITS использует siRNAs для прицельного распознавания. Однако в отличие от RISC RITS связывается с хроматином и инициирует формирование гетерохроматина в противоположность инактивации иРНК. Каким образом siRNAs могут «нацеливать» на определенные, специфичные хромосомные участки? Предложены два возможных механизма. Согласно первой модели, siRNAs, связанные с Ago1 в комплексе RITS, должны как-то соединяться с нераскрученной двойной спиралью ДНК за счет спаривания оснований. Во второй модели связанные с RITS siRNAs должны спариваться основаниями с некодирующими РНК-транскриптами в локусе-мишени (рис. 8.4)

Согласно любой из этих моделей, в результате ассоциации RITS с хроматином посредством siRNAs рекрутируется HKMT Clr4 с последующим метилированием гистонов по H3K9. За этим следуют связывание Swi6 и распространение метилирования H3K9 и гетерохроматина. Однако для ассоциации RITS с хроматином требуется также Clr4, позволяя предполагать, что это обеспечивает метилированные H3K9, к которым может присоединяться комплекс RITS, стабилизируя тем самым свою связь с хроматином. Уже известно, что хромодомен Chp1 специфически связывается с метилированными остатками H3K9 (Partridge et al., 2002), а мутации в Clr4 или хромодомене Chp1, участвующие в этом взаимодействии, приводят к утрате связывания RITS с хроматином (Partridge et al., 2002; Noma et al., 2004). Более того, RITS может также связываться с доменами хроматина, покрытыми метилированным H3K9, через хромодомен Chp1 в mat2/3 и теломерных районах в отсутствие siRNAs (Noma et al., 2004; Petrie et al., 2005). Подводя итог, можно сказать, что комплекс RITS обнаруживает сродство с хроматином через связывание Chp1 с метилированными H3K9 и через спаривание оснований siRNA либо с ДНК, либо с транскриптами РНК.

Недавно полученные данные являются сильным свидетельством в пользу роли RITS и siRNAs в инициации сборки гетерохроматина. Бюлер и соавторы (Buhler et al., 2006) использовали сайт-специфичный белок, связывающийся с РНК, чтобы искусственно привязать комплекс RITS к РНК-транскрипту активного в норме гена ura4⁺. Замечательно, что результатом такой привязки стала генерация siRNAs ura4⁺ и сайленсинг этого гена ura4⁺ по типу, требующему как RNAi, так и компоненты гетерохроматина. Кроме того, эта система позволяла прямо оценивать способность вновь возникших siRNAs инициировать метилирование H3K9 и связывание Swi6, которые являются молекулярными маркерами образования гетерохроматина. Интересно, что вновь образовавшиеся siRNAs ura4⁺ оказались под негативным контролем со стороны консервативной siRNA-рибонуклеазы, Eri1, которая ограничивает их тем локусом, с которого они были произведены. Однако, когда ген, кодирующий Eri1, делегируется, siRNAs ura4⁺ способны действовать в trans-конфигурации и сайленсировать вторую копию гена ura4⁺. вставленную в другую хромосому той же клетки. Этот эксперимент демонстрирует, следовательно, что siRNAs могут действовать как факторы специфичности, направляющие RITS и сборку гетерохроматина на прежде активный район генома.

^{Рис. 8.4. RNAi и siRNA-направляемая сборка гетерохроматина у S. pombe}

^{Для образования siRNA требуются и Dicer, и RDRC. Предполагается, что первоначальное «нацеливание» включает опосредованное RITS и siRNA распознавание похожих транскриптов. Связывание RITS стабилизируется связыванием хромодомена Chp1 с метилированным по H3K9 гистоном. Рекрутирование Clr4 и Swi6 опосредует распространение метилирования по H3K9}

Способность siRNAs инициировать сайленсинг у S. pombe была также исследована другим методом, базирующимся на экспрессии шпилечной РНК для производства siRNAs, гомологичных трансгену GFP (Sigova et al., 2004). В этой системе шпилечные siRNAs стимулировали сайленсинг репортерного гена GFP на уровне PTGS, но не TGS (Sigova et al., 2004). Неясно, почему эти шпилечные siRNAs не могут индуцировать TGS и сборку гетерохроматина в хромосомной копии GFP Одно из возможных объяснений заключается в том, что гетерохроматин собирается в специфических субнуклеарных местах, а сборка вне этих мест происходит неэффективно (Gasser et al., 2004; Глава 4).