3.3. Регуляция случайной Х-инактивации — счет

При случайном способе Х-инактивации клетки пользуются правилом п— 1, при котором на каждый диплоидный! хромосомный набор инактивируются все Х-хромосомы кроме одной. Выбор X, которая будет сайленсирована (или сохранится активной) по существу является случайным, хотя некоторые факторы могут влиять на него (см. раздел 3.4). Регуляция Xist при случайной инактивации строго контролируется Исследования показали, что одиночные эмбриональные стволовые (ES) клетки XX при дифференцировке экспрессируют только лишь одну аллель Xist, тогда как клетки XY никогда не инициируют экспрессию.

^{Рис. 17.4. Регуляция гена Xist в раннем развитии}

^{Рисунок иллюстрирует современные знания и модели импринтированной и случайной регуляции Xist у ранних мышиных эмбрионов XX. Аллель Xm гена Xist приходит в зиготу с репрессивным импринтом, возможно опосредованным антисмысловым локусом Tsix (черный квадратик). Аллель Хр готова к тому, чтобы быть активной, и экспрессируется как только на 2-клеточной стадии происходит активация эмбрионального гена. Со стадии 2 клеток до стадии морулы Хр Xist экспрессируется во всех клетках (экспрессия показана открытым прямоугольником и стрелкой на 5’-конце). Этот паттерн поддерживается на стадии ранней бластоцисты и впоследствии в клетках ТЕ и РЕ и производных от них полностью дифференцированных тканей. В ICM поздней бластоцисты экспрессия Xist прекращается, возможно с помощью ICM-специфичного репрессорного фактора (голубой треугольник). Впоследствии экспрессия Xist начинается во время гаструляции. Здесь блокирующий фактор (черный ромб) гарантирует, чтобы экспрессия Xist не могла происходить на одной из двух аллелей (счет)}

У анеуплоидных или полиплоидных по Х-хромосоме мышиных эмбрионов результат случайной и импринтированной Х-инактивации различен. Простую иллюстрацию этого дают эмбрионы ХО. При импринтированной Х-инактивации эмбрионы XmО являются нормальными, но развитие эмбрионов ХрО замедлено, поскольку клетки пытаются инактивировать свою единственную Х-хромосому, нарушая тем самым развитие экстраэмбриональных тканей. При случайной Х-инактивации клетки считают число своих Х-хромосом (подчиняясь правилу п—1) и таким образом поддерживают единственную Х-хромосому активной, независимо от того, является ли она Xm или Хр. и поэтому не страдают.

Случайный способ Х-инактивации требует, чтобы клетки обладали средствами для определения числа присутствующих Х-хромосом, нередко называемого «счетом» Популярной моделью для объяснения счета является модель блокирующего фактора, предложенная Растаном (Rastan, 1983). Она предполагает, что единственный Xic (аллель Xist) блокирован во всех клетках, обозначая тем самым активную Х-хромосому. Дополнительные Xic (аллели Xist), там где они имеются, экспрессируются, индуцируя таким образом Х-инактивацию (рис. 17.5). Модель Растана предполагает, что Х-инактивация есть состояние «по умолчанию», заключающееся в том, чтобы сохранять одну Х-хромосому активной. Хотя может показаться, что модель противоречит интуиции, она обладает важным достоинством, объясняя большинство сделанных до сегодняшнего времени экспериментальных наблюдений. Природа блокирующего фактора остается, однако, неизвестной.

Наше понимание механизмов, регулирующих экспрессию Xist и инициацию Х-инактивации, очень выиграло от использования клеток ES, культивируемых in vitro. Клетки ES получаются из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, говоря конкретнее, из ICM (рис. 17.4). Они остаются недифференцированными при культивировании в сыворотке с добавкой лейкемического ингибиторного фактора (LIF, leukemia inhibitory factor). Дифференцировку in vitro можно включить удалением LIF из культуральной среды и пересевом клеток на чашки, изготовленные из неадгезивного пластика. В этих условиях они округляются, агрегируют и формируют эмбриоидные тела, внутри которых они дифференцируются, на протяжении всего нескольких дней, во много разных соматических клеточных типов В недифференцированном состоянии ES-клетки XX обладают двумя активными Х-хромосомами. Когда индуцируют дифференцировку этих клеток, большинство клеток эмбриоидного тела претерпевают случайную Х-инактивацию. Напротив, в дифференцированных ES-клетках XY экспрессия Xist и Х-инактивация не происходят Таким образом, ES-клетки представляют собой ценную модельную систему, потому что они поддаются генетическому манипулированию с использованием «нацеливания» на гены, и, таким образом, на них можно изучать различные этапы процесса Х-инактивации. Ключевым экспериментом явилась демонстрация того, что делеция участка длиной 65 т. п.н., локализованного непосредственно «вниз по течению» от Xist, приводит к экспрессии Xist этой аллелью (и, как следствие, к инактивации) даже в дифференцирующихся ES-клетках XY (Clerc and Avner, 1998). Это означает, что делетированные последовательности необходимы для связывания предполагаемого блокирующего фактора. Дальнейшая характеристика участка, ответственного за это, была достигнута с помошью стратегий «замещения — нацеливания», позволяющих получать делеции более мелких участков в пределах этих 65 т. п.н. (рис. 17.6). Определение ключевых элементов и идентификация связывающихся с ними факторов являются главными целями будущих исследований.

^{Рис. 17.5. Модель блокирующего фактора для случайной инактивации Х-хромосомы}

^{Модель блокирующего фактора предполагает, что имеется некий фактор (желтый кружок), который во всех клетках блокирует единственную аллель Xist (зеленый прямоугольник), так что в начале Х-инактивации эта хромосома защищена от идущей Х-инактивации. В мужских клетках (а) присутствует только одна аллель, и блокирующий фактор всегда связывается с нею. В женских клетках (б) существует равная вероятность, что блокирующий фактор свяжется либо с аллелью XmXist (красный цвет), либо с аллелью Хр Xist (синий цвет). В начале Х-инактивации только незаблокированная аллель будет экспрессировать Xist — РНК (зеленая прерывистая линия). Разные алели цетра Х-инактивации могут иметь большее или меньшее сродство к блокирующему фактору, так что у гетерозиготных самок этот фактор предпочтительно связывается с одной Х-хромосомой. В некоторых случаях это может лежать в основе отклонений от первичной неслучайной X-инактивации (рис. 17.7)}