Генетическая стоимость развития на молекулярном уровне

Генетическая стоимость развития на молекулярном уровне

Попытки перенести оценки числа генов, необходимых для развития дрозофилы, на другие организмы сталкиваются с двумя проблемами. Во-первых, геном дрозофилы, по крайней мере в некоторых существенных отношениях, организован, по-видимому, несколько иначе, чем геномы большинства других животных. Вполне возможно, что генетические заключения, сделанные на дрозофиле, окажутся ошибочными при перенесении их на другие организмы. Второе затруднение связано с определением гена. Классическое определение, принятое генетиками, носит в значительной степени операциональный характер: ген определяется по его воздействию на жизнеспособность или на видимый фенотип. К сожалению, генетический анализ большинства организмов, изучаемых эмбриологами, находится лишь в зачаточном состоянии. Для определения числа активных генов у этих животных применяют другой, молекулярный, подход. У молекулярных биологов операциональное определение гена обычно означает нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность белка. Хотя существуют методы, позволяющие разделять белки, относительно часто встречающиеся в клетке, и определять их число, экспериментально оценить число видов редких белков почти невозможно. К счастью, удается определить число различных присутствующих в клетке мРНК и таким образом оценить число функционирующих генов. Определение гена молекулярных биологов в конечном счете во многих случаях придет в соответствие с определением генетиков. Однако далеко не ясно, все ли гены обязательно продуцируют мРНК и содержит ли данная мРНК всю информацию, имеющуюся в гене, с которого она транскрибирована.

Зародыши располагают двумя источниками мРНК: теми мРНК, которые запасаются в яйце во время оогенеза, и теми, которые синтезируются в клетках зародыша в процессе развития. Главное назначение больших и разнообразных запасов мРНК в яйце состоит в том, чтобы дать возможность только что оплодотворенному яйцу начать выполнение грандиозной программы белкового синтеза и обеспечить снабжение клетки белками, необходимыми для сборки ядер, мембран и других субклеточных структур в период быстрого дробления. После того как в результате дробления возникнет достаточное количество ядер, сам зародыш становится способным поддерживать такой уровень синтеза мРНК, который обеспечивает синтез белка, необходимого для дальнейшего развития. Каждый отдельный вид мРНК представляет в зародыше кодирующую часть нуклеотидной последовательности определенного структурного гена. Если обратиться к табл. 3-1, то вряд ли останутся сомнения, что такие матричные последовательности отражают только некоторую часть генома. Очевидно также, что многие регуляторные гены, играющие важную роль в морфогенезе, вовсе не участвуют в синтезе мРНК. Следовательно, используя в качестве показателя числа генов, необходимых для развития, разнообразие мРНК, мы просто упустим из виду очень важный класс генов, который поддается выявлению методами менделевской генетики, потому что мутации этих генов приводят к изменениям фенотипа или к гибели зародышей на разных стадиях развития, как это было описано в предыдущем разделе данной главы. Точно оценить количественный эффект этого расхождения невозможно, но, по счастью, между регуляторными генами и генами, представленными в виде копий мРНК, все-таки существует известное соответствие. Гены, функционирующие как регуляторы морфогенеза, транскрибируются, по крайней мере в некоторых случаях. РНК, обнаруженные Кальтгоффом (Kalthoff) в яйцах насекомого Smittia (см. гл. 4), по-видимому, представляют собой транскрипты генов этого класса, потому что эти РНК обеспечивают фактор, необходимый для дифференцировки переднего конца зародыша. Далее многие структурные гены действительно играют важную роль в развитии и морфогенезе. Гены, детерминирующие белки хориона (оболочка яйца у насекомых), которые рассматриваются несколько подробнее в следующем разделе этой главы, служат полезными примерами генов этой категории. Отдельные гены, кодирующие белки хориона, включаются и выключаются по определенному расписанию в процессе морфогенеза оболочки яйца. Белки хориона несут, разумеется, структурные, а не регуляторные функции, но тем не менее если не произойдут переключения соответствующих генов или если ген окажется дефектным, то это может привести к сборке модифицированной или дефектной структуры.

Использование разнообразия мРНК для оценки числа генов таит в себе и другой источник недоразумений. Чисто генетические методы дают возможность выделять мутации, затрагивающие определенные процессы или периоды развития. Эти мутации выявляют гены, специфически влияющие на онтогенез, а не те гены, которые необходимы для метаболизма или поддержания структуры клеток на всех стадиях развития. Матричные РНК зародышей содержат как последовательности, необходимые для определенных стадий развития, так и последовательности, обеспечивающие жизненно важные функции, и обе эти группы последовательностей вносят свой вклад в создание общего разнообразия популяции мРНК. Разграничить эти две группы последовательностей можно лишь при помощи экспериментов, в которых мРНК зародышевых стадий сравнивают с мРНК взрослых тканей, с тем чтобы определить долю последовательностей, содержащихся в зародышах и являющихся общими для всех стадий. Эти последовательности можно отнести к числу обеспечивающих жизненно важные функции.

Измерения разнообразия мРНК производят, используя методы гибридизации нуклеиновых кислот, сходные с описанными в гл. 3. Однако, вместо того чтобы ренатурировать комплементарные цепи ДНК, кодирующую цепь геномной ДНК гибридизуют с РНК. Поэтому подсчет числа экспрессируемых на данной стадии генов можно производить, определяя долю ДНК, гибридизующейся с мРНК, взятой на любой стадии развития.

Такие оценки можно производить для ряда организмов с разной степенью полноты и успеха. Значения разнообразия мРНК, а тем самым числа активных генов, ответственных за продукцию белков в яйцах и зародышах некоторых первично- и вторичноротых, представлены в табл. 10-3. Оценки разнообразия мРНК, приведенные в этой таблице, получены либо для всей цитоплазматической РНК, либо (предпочтительнее) для РНК, связанной с полисомами, а поэтому, как принято считать, действительно определяющей синтез белка. Полисомная РНК с большей вероятностью содержит лишь «настоящие» мРНК, чем вся цитоплазматическая РНК, однако даже к результатам, полученным на полисомной РНК, следует относиться с осторожностью. Большая часть последовательностей РНК, выявляемых методом гибридизации, слишком редки (представлены небольшим числом молекул), чтобы их можно было идентифицировать по их презумптивным белковым продуктам; их принадлежность к мРНК нельзя считать строго установленной.

Оценки числа активных генов, содержащихся в яйцах и личинках дрозофилы, основанные на данных по гибридизации нуклеиновых кислот, оказываются в общем выше, чем оценки числа генов, специфически необходимых для личиночного развития, произведенные генетическими методами. Это неудивительно, так как следует ожидать, что экспрессируются не только гены, специфичные для развития, но и гены, обеспечивающие жизненно важные потребности организма. В среднем опубликованные оценки разнообразия мРНК близки к генетическим оценкам общего числа генов у дрозофилы. Однако недавно Циммерман и др. (Zimmerman et al), используя методы, позволяющие выявить все классы мРНК, обнаружили в личинках дрозофилы примерно 14500 последовательностей мРНК. Это более чем вдвое выше числа, предсказанного Джаддом и его сотрудниками на основании проведенного ими генетического анализа. Для того чтобы вскрыть причины такого расхождения, необходимы более точные данные о специфичной индивидуальности предполагаемых генов, подсчитываемых этими двумя весьма различными методами.

Таблица 10-3. Разнообразие цитоплазматических РНК, содержащихся в яйцах и зародышах¹⁾

¹⁾ Оценка числа генов производилась по числу обнаруженных видов РНК, исходя из допущения, что в среднем РНК содержит 1500 нуклеотидов. Выражение, используемое для такой оценки (принимая, что транскрибируется только одна цепь ДНК), следующее: размер уникальной части генома, выраженный числом нуклеотидных пар, умноженный на фракцию, представленную в виде РНК, умноженный на два, равен сложности РНК в нуклеотидах. Сложность РНК в нуклеотидах, деленная на среднее число нуклеотидов на мРНК, равна числу видов мРНК.

²⁾ Оценки разнообразия РНК в яйцах относятся ко всей РНК, предположительно к мРНК, потому что белковый синтез в яйцах слишком незначителен, чтобы можно было отделить фракцию функционирующих мРНК от других цитоплазматических РНК.

³⁾ Общая цитоплазматическая РНК.

⁴⁾ мРНК, выделенная из полисом, участвующих в белковом синтезе.

У других организмов, приведенных в табл. 10-3, разнообразие генов, экспрессирующихся в процессе развития в виде мРНК, выше, чем у дрозофилы. Подлинный смысл этого неясен, однако вполне возможно, что различия в разнообразии представляют собой один из аспектов парадокса значений С (несоответствие между морфологической сложностью и количеством ДНК в геномах организмов).

Самые подробные исследования разнообразия мРНК, регулируемого в процессе развития, принадлежат Дэвидсону (Е. Davidson) и его сотрудникам, работавшим на морских ежах Strongylocentrotus purpuratus. Они (см. Galau et al., 1976) сравнивали разнообразие мРНК в тканях развивающихся и взрослых особей. Кроме того, эти исследователи поставили перед собой и другую задачу, возможно, более существенную, чем просто установление числа генов; они пытались оценить число генов, специфичных для определенной стадии развития, и число генов, экспрессирующихся на нескольких разных стадиях и в клетках взрослого организма. Полученные ими данные, приведенные в табл. 10-3, вскрывают любопытный факт. Число генов, экспрессирующихся как белки, в процессе развития морского ежа явно уменьшается, несмотря на резкое возрастание морфологической сложности и дифференцированности в период между началом дробления и стадией плутеуса. Так, мРНК яйца содержат последовательности, имеющиеся также и в мРНК гаструлы, но половина последовательностей, имевшихся в яйце, в гаструле отсутствует. Бластула и плутеус содержат большую часть последовательностей, имеющихся в гаструле, но, кроме того, у них есть и другие последовательности. Были изучены также три ткани взрослого морского ежа, что было просто подвигом, так как взрослый морской еж - это, в сущности, известковая коробка, наполненная гонадами и не содержащая почти ничего другого. Разнообразие мРНК в тканях взрослых особей невелико: в любой ткани число генов, экспрессирующихся в виде мРНК, составляет примерно 2-4 тысячи. Хотя разнообразие мРНК в этих тканях гораздо ниже, чем в гаструле, тем не менее около 1,5-2 тысяч имеющихся у них последовательностей те же, что и у гаструлы. Интересно, что во всех трех тканях этот набор общих с гаструлой последовательностей одинаков.

Быть может, эти 1,5-2 тысячи генов обеспечивают жизненно важные функции, тогда как остальные необходимы для зародышевого развития или поддержания особенностей клеточных типов взрослого организма? О вероятности такого заключения свидетельствуют результаты определений разнообразия мРНК у организмов с крайне простой морфологией, таких как бактерии или грибы. Разумно ожидать, что у таких организмов морфологической организации уделяется очень небольшая часть генной активности, которая направлена главным образом на синтез белков, участвующих в метаболизме, поддержании клеточной структуры и репликации клеток. Как установили Хан (Hahn) и его сотрудники, в клетках Escherichia coli содержится 2300 различных последовательностей мРНК, что, в сущности, соответствует всему геному, принимая, что транскрибируется только одна цепь ДНК. Подобным же образом Херефорд и Росбаш (Hereford, Rosbash) обнаружили, что у дрожжей - одного из самых простых эукариотических организмов - экспрессируются 3000-4000 видов последовательностей мРНК. Другой простой эукариотический организм - гриб Achlya ambisexnalis, который изучали Тимберлейк (Timberlake) и его сотрудники, - содержит примерно 2 или 3 тысячи различных последовательностей мРНК.

Существуют и другие эукариоты с такой же простой морфологией, но при этом обладающие высоким разнообразием мРНК и различиями в генной экспрессии в клетках тех очень немногих типов, из которых они состоят. У гриба Neurospora crassa, который изучали Дутта и Чаудхури (Dutta, Chaudhuri), в мицелии экспрессируются примерно 10 000 генов, а в конидиях - только около 5000. Сходным образом Фиртель (Firtel) наблюдал, что из примерно 16000 генов, экспрессирующихся на протяжении жизненного цикла слизевика Dictyostelium discoideum, примерно 11 000 специфичны для стадии дифференцировки, а около 6000 экспрессируются на всех стадиях. Эти результаты противоречат данным Зентинге (Zantinge) и его сотрудников, обнаруживших, что из примерно 10000 генов, экспрессируемых у гриба Schizophyllum commune, свыше 90% являются общими для морфологически различных типов мицелия. В целом все эти наблюдения о разнообразии генов, экспрессирующихся у простых организмов, интерпретировать трудно. Наблюдаемое высокое разнообразие, возможно, обусловлено отчасти тем, что в этих исследованиях изучалась вся клеточная РНК. Между тем, как показали недавние работы Фиртеля и его сотрудников на Dictyostelium, большая часть этих разнообразных РНК никогда не транслируется в белки. По-видимому, только половина обнаруженных Фиртелем последовательностей РНК служит матричными РНК. Если то же самое относится также к грибам Neurospora и Schizophyllum, то это поможет приблизить оценки числа экспрессируемых генов к данным о разнообразии мРНК у дрожжей и у Achlya. Наиболее разумный подход состоит, возможно, в том, чтобы рассматривать самые низкие числа генов как минимальные их числа, необходимые для обеспечения жизненно важных функций. У некоторых форм большие изменения числа экспрессируемых генов сопровождают довольно простую морфологическую дифференцировку, однако другим формам, не очень сильно отличающимся от первых по своим морфогенетическим возможностям, по-видимому, достаточно очень небольшого числа генов. И опять-таки, ввиду отсутствия надежных данных о функциях экспрессируемых генов мы полагаем, что случаи, в которых экспрессируется небольшое число генов, могут оказаться более полезными для установления минимального числа генов, действительно участвующих в морфологической дифференцировке.

Сравнительно низкое разнообразие мРНК в тканях взрослых морских ежей позволяет считать, что для поддержания дифференцированного состояния у животных необходимо относительно небольшое число генов, экспрессируемых в виде белков. К такому заключению приводят также исследования на дифференцированных тканях высших организмов, как, например, работа Хасти и Бишопа (Hastie, Bishop) на мышах и Акселя (Axel) и его сотрудников на курах. В почках, печени и головном мозге мышей и в яйцеводах и печени кур было обнаружено около 12000 различных мРНК. Как у мышей, так и у кур лишь 10-15% мРНК были специфичны для какой-либо одной ткани. Все прочие мРНК были общими для разных тканей. Данные о том, что 1000-2000 генов, экспрессируемых в виде белков, достаточно для идентификации отдельных тканей, совпадают с результатами, полученными на морских ежах; однако остается открытым вопрос о том, почему такое большое число последовательностей - около 10 000 - встречается в нескольких совершенно различных тканях.

Возможно, что на самом деле положение еще сложнее, чем это вытекает из упомянутых выше исследований. Хан и его сотрудники (Hahn et al.) изучали разнообразие мРНК в головном мозге мыши методом гибридизации, позволяющим выявлять более редкие последовательности мРНК, чем те, которые наблюдали Хасти и Бишоп, а также Ван-Несс и сотр. (Van-Ness et al.), и обнаружили 170000 различных мРНК. Следует помнить, что головной мозг - необычайно сложный орган, состоящий, возможно, из клеток нескольких сот типов и подтипов. Поэтому высокое разнообразие мРНК отражает, быть может, высокую степень разнообразия клеток в этой ткани.

Камалей и Гольдберг (Kamalay, Goldberg) обнаружили также, что в тканях высшего растения - табака - большое число генов экспрессируется в виде мРНК. В листьях, стебле, корне, лепестках, пыльниках и завязи содержится около 25000 последовательностей. Примерно две трети их содержатся во всех тканях, а 6000-10000 специфичны для отдельных тканей.

Однако нас здесь интересует генетическая стоимость онтогенеза как такового. Быть может, располагая оценками всего лишь по двум организмам, делать обобщения рискованно. Как у дрозофилы, так и у морского ежа Strongylocentrotus относительно большая доля генов, экспрессируемых в какое-то ограниченное время в течение жизненного цикла, экспрессируется специфическим образом во время онтогенеза. Ответить на главный вопрос - какая часть этих генов контролирует морфогенез - в настоящее время просто невозможно. В целом доля генов, связанных с морфогенезом, возможно, и велика, однако, сколь это не парадоксально, число генов, на самом деле регулирующих морфогенез, может быть небольшим. Многие структурные гены, необходимые для морфологических процессов онтогенеза, поставляют продукты, без которых невозможна сборка отдельных морфологических структур. Между тем эти гены практически не поставляют регуляторной информации; более того, регуляции подвержены их собственные функции. Гены этого типа нельзя, однако, считать несущественными, так как продукты некоторых из них, например тубулины, актины или белки клеточной поверхности, создают механизмы, обеспечивающие изменение формы клеток и клеточные движения, непосредственно участвующие в морфогенезе. Большая часть контрольных функций, выполняемых регуляторными генами, этими «серыми кардиналами» генетики, очевидно, состоит в том, чтобы обеспечивать гармоничную экспрессию специфичных для онтогенеза структурных генов. Будь число регуляторных генов очень велико, взаимодействия между ними были бы столь сложны, что жизнеспособные эволюционные изменения оказались бы почти невозможными. О том, что число этих генов невелико, во всяком случае в тех нескольких случаях, для которых имеются количественные оценки числа регуляторных генов, свидетельствуют приведенные в гл. 3 данные, показывающие, что у двух гавайских дрозофил форму головы детерминируют 10 или менее генов. Относительно небольшое число генов определяет основные особенности разных сегментов у дрозофилы (большая часть головных сегментов и судьба сегментов тела детерминируется 15 генами; см. гл. 8) и число пальцев у млекопитающих или число амбулакров у иглокожих (гл. 5).