6. Как формирование гетерохроматина «нацеливается» у Drosophila?

Хотя мы многое узнали о механистических аспектах и биохимии структуры гетерохроматина, как это описано выше, остается открытым вопрос о том, каким образом формирование гетерохроматина «нацеливается» на избранные районы генома в его нормальной конфигурации. Все гетерохроматиновые домены обладают некоторыми общими чертами, и две такие особенности признаны существенными входными сигналами [inputs] для сборки гетерохроматина на данной нуклеотидной последовательности ДНК: положение локуса относительно пространственно обособленных [distinct] субдоменов гетерохроматина в ядре и присутствие повторяющейся ДНК

^{Рис. 5.6. Переход из эухроматинового состояния в гетерохроматиновое состояние требует ряда изменений в модификациях гистонов}

^{(а) Активные гены маркированы H3K4me2 и me3; эта метка, если присутствует, предположительно должна быть удалена LSD1 (у Drosophila пока еще не охарактеризован). В эухроматине НЗК9 в норме апетилирован; эта метка должна быть удалена деацетилазой гистонов, HDAC1. Фосфорилирование H3S10 может интерферировать с метилированием НЗК9; дефосфорилирование, по-видимому, происходит с участием фосфатазы, «нацеливаемой» взаимодействием с карбоксильным концом киназы JIL1 Эти переходы создают обстановку для приобретения модификаций, связанных с сайленсингом (показано на б), в том числе метилирования НЗК9 белком SU(VAR)3-9, связывания НР1 и последующего метилирования Н4К20 белком SUV4-20, ферментом, рекрутируемым НР1. Может также происходить метилирование НЗК27 энзимом E(Z)}

В целом гетерохроматиновые массы видны на периферии ядра и вокруг ядрышка. У эмбрионов Drosophila эта тенденция выражена еще более отчетливо. Гетерохроматиновые массы впервые видны в раннем эмбриогнезе, когда ядра перемещаются к периферии яйца. Раннее развитие у Drosophila является синцитиальным вплоть до 14-го цикла ядерных делений, когда образуются клеточные стенки между ядрами, и образуется типичная бластула (шарик из клеток). Гетерохромати новый материал (центромеры, четвертая хромосома) концентрируется на одной стороне ядра, ориентированной в сторону внешней поверхности яйца (Foe and Alberts, 1985). Такое пространственное подразделение ядра сохраняется в ходе развития, приводя к концепции [the concept] гетерохроматиновых «компартментов» в ядре. Эти компартменты могут поддерживать высокую концентрацию факторов, необходимых для формирования гетерохроматина (таких как НР1 и HKMTs), и в то же время могут быть лишены факторов, необходимых для сборки эухроматина и экспрессии генов (таких как HATs и RNA pol II). Действительно, было показано, что близость к гетерохроматиновым массам, как по положению вдоль по длине хромосомы, так и в трех измерениях, является одним из факторов в PEV.

Было показано, что близость к массе центрического [centric] гетерохроматина влияет на мозаицизм как для эухроматиновых генов (примером которых является white; см. выше), так и для гетерохроматиновых генов (наиболее изученными примерами которых являются light и rolled). Можно наблюдать, что гетерохроматиновые гены, картированные в эти домены, обнаруживают мозаичность, когда перестройка помещает их в непосредственной близости от эухроматина; обычно они демонстрируют противоположную зависимость, требуя для полной экспрессии нормальных уровней HP 1 и показывая усиление мозаичности, когда количество НР1 мало.

Мозаицизм light зависит не только от его близости к эухроматину, но и от положения точки разрыва а именно от расстояния от гетерохроматина, измеряемого по длине хромосомного плеча (Wakimoto and Hearn 1990). Аналогичные данные были опубликованы для rolled. Исследования brown dominant (bw^D), эухроматинового гена, мозаицизм экспрессии которого был индуцирован вставкой повторяющейся ДНК, показали, что сдвиг в степени близости этого локуса к центрическому гетерохроматину может приводить к усилению сайленсинга (если ближе) или подавлению сайленсинга (если дальше) (Henikoff et al., 1995). Аналогичным образом транслокация четвертой хромосомы, несушей репортер white, в дистальную половину хромосомного плеча 2L или 2R приводит к резкой утрате сайленсинга; в ядрах слюнных желез это коррелирует с изменением во внутриядерном расположении, вплоть до того, что часто оказываются занятыми сайты, удаленные от хромоцентра (Cryder-manetal., 1999а).

В недавнем исследовании с использованием микроскопии высокого разрешения изучали как активность гена (используя антитела, специфичные к продукту), так и ядерную локализацию репортера (используя FISH — fluorescence in situ hybridization) в одной и той же клетке в нормальных временных рамках экспрессии. Инверсия, вызывающая мозаицизм white, а также bw^D и трансген lacZ с мозаичной экспрессией изучались в дифференцирующихся глазных дисках или в глазах взрослых мух. В этом исследовании обнаружили сильную корреляцию между положением репортерного гена в клеточном ядре по отношению к перицентромерному гетерохроматину и уровнем экспрессии, что говорило в пользу существования гетерохроматинового «компартмента» и корреляции между положением в этом компартменте и сайленсингом гена (Harmon and Sedat, 2005). Однако эта корреляция не является абсолютной. Это неудивительно, при том что исследования с репортером white указывают на присутствие как эухроматиновых, так и гетерохроматиновых доменов, чередующихся в маленькой четвертой хромосоме (которая всегда располагается вблизи массы перицентромерного гетерохроматина). Эти последние наблюдения указывают на другие локальные детерминанты, вносящие вклад в упаковку хроматина в той или в другой форме.

У D. melanogaster, согласно оценке по цитологическим критериям, одна треть генома является гетерохроматиновой. Сюда входят крупные блоки, которые фланкируют центромеры, более мелкие блоки, связанные с теломерами, вся Y-хромосома и большая часть маленькой четвертой хромосомы. Центромерные районы состоят из крупных (0,2—1 млн о.) блоков сателлитной ДНК, чередующихся с «островками» сложных нуклеотидных последовательностей, обычно мобильных элементов (Le et al., 1995). Эти районы, хотя и бедны генами, не лишены их вовсе; согласно современным оценкам, в перицентромерном гетерохроматине находятся несколько сотен генов (Hoskins et al., 2002). Теломеры Drosophila не содержат типичных повторов, обогащенных G, которые наблюдаются в других местах, но состоят из копий ретротранспозонов НеТ-А и TART. Ассоциированные с теломерами последовательности (TAS — telomere-associated sequences), блоки из повторов 10²—10³ нуклеотидов, обнаруживаются в проксимальном положении, и трансгенные репортеры white, вставленные в эти районы, демонстрируют мозаичный фенотип. Хотя Y-хромосома и несет гены для ряда факторов мужской фертильности, основная масса этой хромосомы составлена из сателлитной ДНК, и она остается конденсированной во всех клетках за исключением мужской зародышевой линии. Размеры маленькой четвертой хромосомы порядка 4,3 млн о., в том числе около 3 млн о., состоящих из сателлитной ДНК. Дистальные 1,2 млн о. могут считаться эухроматиновыми в том отношении, что они политенизированы в слюнной железе (см. рис. 5.4), но, судя по их поздней репликации, полному отсутствию в них меиотических обменов и по их связи с НР1, НР2 и H3K9me2, они, по-видимому, являются гетерохроматиновыми (рис. 5.4). Плотность фрагментов транспозонов в этом районе в шесть—семь раз выше, чем в эухроматиновых плечах, подобно участкам на границе между центрическим гетерохроматином и эухроматином на других хромосомах (Kaminker et al., 2002). Интересно, что в исследованиях четвертой хромосомы с помощью P-элемента с репортером white, обсуждавшегося выше (рис. 5.3а), обнаружили чередование как эухроматиновых доменов (приводящих к «красноглазому» фенотипу) так и гетерохроматиновых доменов (приводящих к мозаичному фенотипу) (Sun et al., 2004).

Эти данные заставляют предполагать присутствие локальных элементов в ДНК, способных управлять формированием гетерохроматина или эухроматина. Генетический скрининг на переключение фенотипа (с красной окраски на мозаичность и наоборот) показал, что локальные делеции или дупликации 5—80 т.о. ДНК, фланкирующей транспозонный репортер, могут приводить к утрате или приобретению мозаичности, указывая на наличие cis-действующих (на короткие расстояния) детерминантов сайленсинга (рис. 5.7). Этот сайленсинг зависит от НР1 и коррелирует с изменением в структуре хроматина, как показывает изменение в доступности для нуклеаз; все это указывает на сдвиг от эухроматинового к гетерохроматиновому состоянию. Данные по картированию в одном из районов четвертой хромосомы позволяют предполагать, что транспозон 1360 является мишенью для формирования гетерохроматина, и показывают, что, коль скоро формирование гетерохроматина начинается в диспергированных повторяющихся элементах, оно может распространяться вдоль по длине четвертой хромосомы примерно на 10 т.о. или пока не столкнется с конкуренцией со стороны эухроматинового детерминанта (Sun et al., 2004). Наблюдения, показывающие, что тандемные или инвертированные повторы репортерных Р- элементов приводят к формированию гетерохроматина и сайленсингу генов, также позволяют предполагать наличие действующих на короткие расстояния cis-активных детерминантов, связанных с числом копий (Dorer and Henikoff, 1994).

Такие cis-активные элементы в ДНК могли бы функционировать посредством сиквенс-специфичного связывания белка, способного включать формирование гетерохроматина Были идентифицированы белки, специфически связывающиеся с некоторыми из сателлитных ДНК (например, D1 — Aulner et al., 2002). Вывод о важности этих взаимодействий был сделан, исходя из влияния специфичных для сателлитной ДНК веществ, связывающихся с ДНК и способных подавлять PEV (Janssen et al., 2000). Однако данные, полученные на дрожжах и растениях (Elgin and Grewal, 2003; Matzke and Birchler, 2005; см. Главы 8 и 9), позволяют предложить другую модель, а именно, что некий основанный на RNAi механизм мог бы использоваться для «нацеливания» формирования гетерохроматина на повторяющиеся элементы. Работы из нескольких лабораторий показали, что система RNAi у Drosophila имеется и играет важную роль в регуляции в ходе развития посредством посттранскрипционного сайленсинга генов (PTGS). D. melanogaster обладает двумя генами, кодирующими белки DICER, и многочисленными генами (aubergine, AGO1, AGO2, spindle [известный также как homeless], vasa intronic gene [VIG], armitage, Fmr1), кодирующими компоненты или белки, необходимые для сборки индуцируемого РНК сайленсирующего комплекса (RISC) (Sontheimer, 2005). Участие этой системы предположили в PTGS повторяющихся последовательностей, особенно тандемно повторяющихся генов Stellate, нескольких ретротранспозонов и трансгенов Alcohol dehy-rogenase (Adh) и в транскрипционном сайленсинге (TGS) трансгенов Adh (Aravin et al., 2001; Pal-Bhadra et al., 2002). Пал-Бхадра с соавторами (Pal-Bhadra et al., 2004) обнаружили при прямом тестировании, что мутации вpiwi (член семейства домена PAZ) и homeless (DEAD-боксовая геликаза) подавляют PEV, связанный с тандемными порядками гена white, и что мутации в piwi, aubergine и homeless подавляют сайленсинг трансгена white P[hsp70-w] в перицентромерном гетерохроматине или четвертой хромосоме. Эта супрессия PEV была связана со значительным снижением уровня метилирования H3K9. Связанные с повторами малые интерферирующие РНК (rasiRNAs) были идентифицированы с 40 % известных мобильных элементов (включая 1360) и других повторяющихся последовательностей (Aravin et al., 2003).

^{Рис. 5.7. Возможная модель гетерохроматинового «нацеливания»}

^{dsRNA с повторяющихся последовательностей процессируется с помощью RISC и генерирует гипотетический «комплекс нацеливания», который управляет либо модификацией гистонов, либо ассоциацией с НР1 как начальным этапом в сборке гетерохроматина в сайте, идентифицированном малой ssRNA. Данные, полученные на четвертой хромосоме, позволяют предположить, что фрагменты ДНК-транспозона 1360 (оранжевые полосы) являются мишенью для формирования гетерохроматина: локальные делеции или дупликации, которые сдвигают положение репортера R-элемента (треугольник) в сторону от элемента 1360, ведут к утрате сайленсинга (красный треугольник обозначает красный глаз), тогда как близость к 1360 приводит к сайленсингу (треугольник с точками обозначает мозаичный глаз) (на основе данных Sun et al., 2004)}

В совокупности эти обсуждавшиеся выше результаты заставляют предполагать, что формирование гетерохроматина может зависеть как от ядерной локализации (возможно, создающих богатый пул требующихся белков), так и от специфического «нацеливания» на основе RNAi-распознавания и процессинга двунитевой РНК с повторяющихся элементов, в особенности некоторых из ДНК-транспозонов. Такое «нацеливание» посредством RISC могло бы привлечь либо метилтрансферазу гистона H3, либо комплекс, включающий НР1 (либо и то, и другое) к сайту для включения процесса сборки, обсуждавшегося в разделе 4.