8.2. Сайленсинг индуцируется двунитевой РНК

Двунитевая РНК (dsRNA) является вероятным первичным триггером для индуцируемого трансгеном сайленсинга, наблюдаемого у Paramecium. Сайленсирующая эффективность трансгенов коррелирует с образованием аберрантных молекул РНК, соответствующих как смысловой, так и антисмысловой нитям инъецированной последовательности. Более того, способность dsRNA стимулировать сайленсинг гена была продемонстрирована путем скармливания клеткам Paramecium бактерий Escherichia coli, экспрессирующих dsRNA клонированного гена, с использованием методологии, разработанной для Caenorhabditis elegans (Timmons and Fire, 1998; Timmons et al., 2001). Сайленсинг эндогенного гена можно наблюдать фенотипически спустя всего три вегетативных деления, т.е. меньше чем через 24 часа (Galvani and Sperling, 2002). Скармливание убитых нагреванием E.coli цнфузориям-спиротрихам, в норме питающимся водорослями, также индуцирует генный сайленсинг (Pashka et al., 2003), заставляя предполагать, что многие разные инфузории обладают этим механизмом. У Paramecium молекулярный анализ показал, что кормление dsRNA приводит к накоплению таких же -23-нуклеотидных siRNAs, какие наблюдаются после сайленсинга, индуцируемого трансгеном (Nowacki et al., 2005); это указывает, что оба эти явления базируются на общем RNAi-пути.

Сайленсинг, индуцируемый у Paramecium скармливанием dsRNA, может быть немедленно ревертирован замещением E.coli в культуральной среде нормальными пищевыми бактериями; аналогичным образом прямая микроинъекция dsRNA в цитоплазму индуцирует лишь временный, преходящий сайленсинг гомологичных генов, предположительно потому, что инъецированная dsRNA быстро разбавляется в ходе вегетативного роста (Galvani and Sperling, 2002). Эти наблюдения позволяют предположить, что молекулы dsRNA не могут быть амплифицированы до сколько-нибудь значительного уровня в цитоплазме вегетативных клеток, в отличие от судьбы dsRNA в С.elegans, где это может приводить к наследуемому сайленсированному состоянию. Это, далее, предполагает, что RNAi у Paramecium не приводит к установлению стабильного транскрипционного сайленсинга гена в макронуклеусе. Наследуемый сайленсинг, вероятно, требовал бы метилирования гистона H3K9. А, как упоминалось выше, эта модификация, очевидно, отсутствует в вегетативном макронуклеусе, по крайней мере у Т. thermophila.