4. Модификация гистонов играет ключевую роль в сайленсинге гетерохроматина

Анализ SU(VAR)3-9 позволил идентифицировать ключевую функцию, необходимую для сайленсинга гетерохроматиновых генов (Tschiersch et al., 1994). Этот белок содержит домен SET, функционирующий как фермент в метилировании H3K9 гистонов. То, что этот белок является метилтрансферазой лизина гистонов (HKMT), «нацеленной» на H3K9, было впервые показано в ходе изучения гомологичного белка человека, SUV39H1 (Rea et al., 2000). У Drosophila SU(VAR)3-9 является главной, но не единственной HKMT H3K9 (Schotta et al., 2002; Ebert et al., 2004). SU(VAR)3-9 контролирует диметилирование H3K9в основной массе перицентромерного гетерохроматина, но не в четвертой хромосоме, теломерах или эухроматиновых сайтах. Триметилирование H3K9, которое у Drosophila наблюдется, главным образом, во внутреннем хромоцентре, также контролируется SU(VAR)3-9. Диметилирование этого внутреннего района не зависит от SU(VAR)3-9, как и монометилирование H3K9 в перицентромерном гетерохроматине (Ebert et al., 2004). HKMTs, ответственные за эти модификации, все еще неизвестны. Важное значение диметилирования H3K9 в сайленсинге гетерохроматиновых генов демонстрируется сильным зависящим от дозы влиянием SU(VAR)3-9 на PEV (обсуждается выше), атакже тем фактом, что супрессия сайленсинга генов мутациями Su(var)3-9 коррелирует с активностью их HKMT Ферментативно гиперактивная мутация Su(var)3-9 ^pth является сильным энхансером PEV и вызывает повышенное содержание H3K9me2 и H3K9me3 в хромоцентре, а также порождает заметные сигналы H3K9me2 во многих эухроматиновых сайтах (эктопический гетерохроматин). S-Аденозилметионин функционирует как донор метальной группы для всех этих реакций метилирования; следовательно, мутации в гене, кодирующем S-аденозилметионинсинтазу, Su(z)5, являются доминантными супрессорами PEV (Larsson et al., 1996).

Исследования с использованием генов Su(var) начали вскрывать последовательность молекулярных реакций, необходимых для установления гетерохроматиновых доменов. Связывание SU(VAR)3-9 в гетерохроматиновых нуклеотидных последовательностях зависит как от его хромодоменов, так от SET-доменов (Schotta et al., 2002). Как контролируется SU(VAR)3-9 — все еще неизвестно. Метилирование H3K9 белком SU(VAR)3-9 устанавливает сайты связывания для НР1. Хромодомен НР1 специфически связывается с H3K9me2 и H3K9me3 (Bannister et al., 2001; Lachner et al., 2001). Что SU(VAR)3-9 связывается с HP1, было показано двугибридными тестами на дрожжах [yeast two-hybrid tests] и иммунопреципитацией (Schotta et al., 2002). Район SU(VAR)3-9, аминотерминальный по отношению к его хромодомену взаимодействует с доменом «chromoshadow» НР1. Этот район SU(VAR)3-9 взаимодействует также с карбокситерминальным доменом SU(VAR)3-7. SU(VAR)3-7 взаимодействует в трех разных сайтах с доменом «chromoshadow» НР1 (Delattre et al., 2000). При таком паттерне взаимодействий можно предположить, что эти три белка — НР1, SU(VAR)3-7 и SU(VAR)3-9 — физически связаны в мультимерных белковых комплексах гетерохроматина.

Ассоциация SU(VAR)3-9 и НР1 с перицентромерным гетерохроматином является взаимозависимой (Schotta et al., 2002). SU(VAR)3-9 вызывает диметилирование H3K9, который специфически узнается хромодоменом НР1 (Bannister etal., 2001; Lachner etal., 2001). Следовательно, у личинок нуль-Su(var)3-9 связывание НР1 с перицентромерным гетерохроматином нарушено (см. рис. 5.4Ь). Это отражает специфическую активность НР1, который связывается с H3K9me2, но не с H3K9me1; SU(VAR)3-9 не затрагивает монометилирование (Ebert et al., 2004). Диметилирование H3K9 во внутреннем хромоцентре, четвертой хромосоме в теломерах и в эухроматиновых сайтах не зависит от SU(VAR)3-9, и, следовательно, в мутантных линиях НР1 продолжает обнаруживаться во всех этих сайтах. В клетках дикого типа SU(VAR)3-9 связывается с этими сайтами, но, по-видимому, неактивен; неизвестная HKMT контролирует метилирование H3K9 в этих районах.

Напротив, если НР1 не присутствует (устранен мутациями), SU(VAR)3-9 больше не связывается с пери-центромерным гетерохроматином, но обнаруживается также по длине эухроматиновых хромосомных плечей (рис. 5.46). Теперь он виден почти во всех бэндах, где он вызывает эктопическое моно- и диметилирование H3K9 (H3K9me1 и H3K9me2) (рис. 5.5). Таким образом, НР1 существен для ограниченного связывания SU(VAR)3-9 с перицентромерным гетерохроматином. Эти данные позволяют представить себе последовательность реакций, начинающуюся со связывания SU(VAR)3-9 с гетерохроматиновыми доменами и последующего образования H3K9me2. Эта метка распознается хромодоменом НР1; связывание SU(VAR)3-9 с доменом «chromoshadow» белка НР1 обеспечивает его ассоциацию с гетерохроматином. Был создан химерный белок НР1-РС, в котором хромодомен НР1 был заменен хромодоменом белка Polycomb (PC) (Platero et al., 1996). Хромодомен PC прочно связывается с H3K27me3 (Fischle et al., 2003). Химерный белок HP1-PC узнает, следовательно, сайты связывания H3K27me3 Polycomb в эухроматиновых плечах; в присутствии такого химерного белка НР1-РС белок SU(VAR)3-9 также обнаруживается в сайтах связывания PC, демонстрируя свою сильную связь с доменом «chromoshadow» белка НР1 (Schotta et al., 2002).

В клетках нуль-SU(VAR)3-9 сильно уменьшено содержание еще одной гетерохроматин-специфичной метки метилирования — триметилирования H4K20 (H4K20me3) (Schotta et al., 2004). Было показано, что взаимозависимость между диметилированием H3K9 и триметилированием H4K20 отражает взаимодействие между белками SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20. SUV4-20 является HKMT, контролирующей метилирование H4K20 в гетерохроматине. Это гетерохроматин-специфичная метка метилирования сильно ослаблена в нуль-клетках по SU(VAR)3-9, как и по НР1, заставляя предполагать ассоциацию SU(VAR)3-9, НР1 и SUV4-20 в комплекс взаимно зависимых белков. Мутации в гене Suv4-20 вызывают сильную супрессию индуцированного PEV сайленсинга генов, показывая, что для этого процесса требуется метка H4K20me3.

^{Рис. 5.5. Взаимодействие SU(VAR)3-9 и НР1 в установлении паттерна распределения H3K9me}

^{(a) SU(VAR)3-9 отвечает за деметилирование НЗК9 (H3K9me2); утрата энзима приводит к утрате этой модификации в перицентромерном гетерохроматине, как показывает утрата окрашивания антителами политенных хромосом (сравни среднюю панель с верхней панелью). Утрата НР1 приводит к утрате «нацеливания» SU(VAR)3-9; высокие уровни H3K9me2 видны теперь на всех хромосомных плечах (нижняя панель), (б) YH1 взаимодействует с H3K9me2 через свой хромодомен, а с SU(VAR)3-9 — через домен «chromoshadow». Узнавая и модификацию гистонов, и фермент, отвечающий за эту модификацию, НР1 обеспечивает механизм распространения гетерохроматина и эпигенетического наследования}

Третья метка метилирования гистонов, функционально связанная с формированием гетерохроматина, — это метилирование H3K27, катализируемое HKMT E(Z). У Drosophila E(Z) контролирует все моно-, ди- и триметилирование H3K27 и в эухроматине, и в гетерохроматине. Следовательно, в нуль-клетках по E(z) все метилирование H3K27 утрачивается (Ebert et al., 2004). На функцию метилирования H3K27 в сайленсинге гетерохроматиновых генов указывает как Su(var)-эффект мутаций E(z) типа утраты функции, так и энхансерный эффект дополнительных копий гена E(z) (Laible et al., 1997). Неясно, является ли этот эффект прямым или косвенным. Метилирование H3K27 является критическим для системы сайленсинга Polycomb, которая действует в эухроматиновых доменах. Между паттернами распределения и функциональными ролями PC и НР1 наблюдается относительно небольшое перекрывание. Каким образом могла бы осуществляться подгонка метилирования H3K27 к зависимым от НР1 гетерохроматиновым комплексам — еще предстоит выяснить. Белок НР1 выполняет центральную линкерную функцию в формировании гетерохроматина и ассоциированном сайленсинге генов, связывании H3K9me2 и H3K9me3 и взаимодействии непосредственно с SU(VAR)3-9 и несколькими дополнительными белками. Учитывая число идентифицированных локусов Su(var), эта модель определенно становится более сложной. У млекопитающих и растений метилирование H3K9 гистонов и метилирование ДНК представляют взаимосвязанные метки репрессированного хроматина (Martienssen and Colot, 2001; Bird, 2002). Происходит ли вообще метилирование ДНК у Drosophila или нет, многие годы было предметом полемики. Недавние сообщения о низком уровне метилирования ДНК у ранних эмбрионов вновь подогрели эту дискуссию (Kunert et al., 2003). Анализ генома показывает, что единственная имеющаяся различимая ДНК-метилтрансфераза — это Dnmt2. Мутации в этом гене мало влияют на организм. Тем не менее, его роль в раннем эмбриогенезе исключать нельзя.