2.1. Регуляторы метилирования ДНК у растений

Метилирование 5-го углеродного остаткав цитозине ДНК— признак эпигенетической инактивации и гетерохроматина у растений и животных (табл. 18.1). Однако у растений метилирование ДНК имеет ряд уникальных черт в отношении характера (профиля) метилирования ДНК. ферментов ДНК-метилтрансфераз и возможности обратимости метилирования в неделящихся клетках (Chan et al., 2005). В этом разделе мы описываем белки, необходимые для генерации, поддержания, интепретации и «стирания» картины метилирования ДНК Специальные компоненты для PHК-направляемого метилирования ДНК представлены в разделе 3.4.

ДНК-метилтрансферазы

Различают de novo и поддерживающее метилирования ДНК De novo метилирование осуществляет модификацию прежде неметилированных последовательностей ДНК (рис. 18.1). У растений это метилирование может затрагивать CpG, CpNpG и CpNpN последовательности (где N - А, Т или С). В отличие от растений у животных метилирование ДНК, в основном ограничивается CpG динуклеотидами и пока нет сведений о существенном метилировании цитозиновых остатков в асимметричных CpNpN сайтах. Хотя природа сигналов, запускающих de novo метилирование ДНК, в основном пока еще неизвестна, однако у растений эту роль могут выполнять двутяжевые РНК (раздел 3.4). Поддерживающее метилирование сохраняет картину (pattern) метилирования генома при репликации ДНК и особенно эффективно затрагивает CpG и CpNpG нуклеотидные последовательности, обладающие палиндромной симметрией. Поддерживающему метилированию подвержены полуметилированные ДНК после репликации или репарации, у которых «гидом» для узнавания метилируемых сайтов в новообразованной цепи служат метилированные цитозиновые остатки в материнской цепи. Хотя считается, что у растений de novo и поддерживающее метилирования ДНК осуществляются разными ферментами, тем не менее, есть мнение и о том, что ферменты с различной сайтовой (CpG или не CpG) специфичностью могут часто делать то и другое.

У растений имеются три консервативных семейства ДНК-метилтрансфераз. Ферменты из семейства МЕТ1 ДНК-метилтрансфераз — гомологи животных ДНК-метилтрансфераз типа Dnmt1 (глава 18) в основном являются поддерживающими CpG метилирование ДНК ферментами, хотя одна из них участвует в de novo CpG метилировании при направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 3.4). Класс Dnmt2 ферментов, из которых один закодирован в геноме арабидопсиса, представлен семейством наиболее широко распространенных и высоко консервативных ДНК-метилтрансфераз (табл. 9.2), функция которых все еще не известна. Растительные DRM (domains rearranged methyltransferases) ДНК-метилтрансферазы и их гомологи ферментов (группа Dnmt3) млекопитающих обычно рассматриваются как de novo метилтрансферазы. Эти ферменты катализируют метилирование цитозиновых остатков во всех контекстах и участвуют в направляемом РНК метилировании ДНК (раздел 4). Как это следует из названия, домены в этих ферментах реаранжированы: в отличие от Dnmt3 у DRM белков домены I-V следуют за доменами VI-X. Это может придавать этим ферментам способность метилировать асимметричные CpNpN нуклеотидные последовательности, которые в клетках млекопитающих не метилируются. Специфичная для растений хромометилаза СМТЗ модифицирует цитозиновый остаток в тринуклеотиде CpNpG. Подобно ферменту МЕТ1 эта метилтрансфераза участвует как в de novo, так и в поддерживающем метилировании ДНК. Истинная функция СМТЗ все еще не совсем ясна, хотя известно, что утрата ее активности у соответствующих мутантов сопровождается реактивацией некоторых молчащих транспозонов (Chan et al., 2005).

В отличие от млекопитающих, у которых dnmtl и dnmt3 мутанты погибают во время эмбрионального развития или сразу же после рождения животного, растительные мутанты met1, cmt3 и drm жизнеспособны и обычно даже фертильны. Такая жизненность дефектных по ДНК-метилтрансферазам растительных мутантов позволяет более экстенсивно анализировать роль таких мутаций во время развития и половой репродукции растений, что вообще невозможно сделать в отношении млекопитающих (Chan et al., 2005).

Активное CpG деметилирование и ДНК-гликозилазы

Эпигенетическая регуляция свидетельствует о том, что активное или неактивное состояния генов потенцильно обратимы. Метилирование ДНК разрешает такую обратимость, потому что оно может пассивно или активно утрачиваться. Пассивная утрата происходит, когда метилирование невозможно в течение нескольких раундов репликации. Напротив, активное деметилирование может протекать в неделящихся клетках при наличии соответствующих энзиматических активностей. Относительно недавние сведения из биохимии животных указывают на то, что активное деметилирование может осуществляться под действием ДНК-гликозилаз, которые обычно участвуют в эксцизионной репарации ДНК путем выстригания оснований (Kress et al., 2001). Интерес к этому механизму вспыхнул вновь после открытия у арабидопсиса Demeter (DME) и репрессора сайленсинга (ROS1), которые представляют собой крупные белки с ДНК-гликозилазными доменами. ROS1 ген был идентифицирован при скрининге мутаций, приводящих к эпигенетической down-регуляции и гирперметлированию стабильно экспрессируемого репортерного гена (Gong et al., 2002). ROS1 белок гидролизовал (никировал) метилированную, но не неметилированную ДНК, что совпадало с его ролью в удалении метилированных цитозиновых остатков из ДНК путем выстригания основания при эксцизионной репарации ДНК. ROS1 экспрессируется конститутивно и поэтому в принципе может участвовать в утрате метилированных оснований у ДНК в неделящихся клетках на всех этапах развития (Kapoor et al., 2005а). Напротив, DME активность выявлена только в женском гаметофите, где она активирует фактор импринтинга Medea (МЕА) в зависимости от активности ДНК-гликозилазного домена (Choi et al., 2002). CG метилтрансфераза MET1 является антагонистом DME. Это указывает на то, что DME белок на самом деле нужен для деметилирования CG динуклеотидов (Hsieh and Fisher, 2005). У Arabidopsis имеются еще два уникальных для растений неохарактеризованные пока представителя семейства DME/ROS1. Такая своеобразная экспансия генов этого семейства указывает на то, что обратимое замалчивание генов путем активного деметилирования ДНК важно для физиологии растений, для их развития или адаптации к условиям среды.

Метил-ДНК связывающие белки

Считается, что MBD белки с метил-ДНК связывающим доменом участвуют в трансдукции собственно характера метилирования ДНК в измененную транскрипционную активность. У млекопитающих MBD белки связываются с метилированной ДНК и рекрутируют деацетилазы гистонов для усиления сайленсинга транскрипции. Arabidopsis имеет 12 MBD-содержащих генов по сравнению с 11 генами у млекопитающих, пятью генами у Drosophila, двумя генами у С. elegans и с отсутствием их в геномах грибов (Hung and Shen, 2003). Несмотря на то, что еще мало известно о функциях MBD белков у Arabidopsis, тем не менее нокдаун с помощью PHKi одного из них, AtMBD 11, связан с плейотропными эффектами при развитии растений (Springer and Kaeppler, 2005). Ни один из MBD белков Arabidopsis не идентифицирован при генетическом скрининге, возможно из-за функциональной избыточности. Кроме того, несмотря на консерватизм аминокислотных последовательностей ДНК-метилтрансфераз у растений и животных, MBD-содержащие белки у представителей этих двух царств дивергировали целиком вне метил-CG-связывающего домена. Тем самым, хотя животные и растения используют для создания и поддержания картины метилирования генома родственные ферменты, они могут иметь возникшие в эволюции разные пути интерпретации этих картин с помощью определенных MBD белков (Springer and Kaeppler, 2005).

Компоненты системы синтеза донора метильных групп

Метилирующие ферменты нуждаются в активированных метильных группах обычно в виде S-аденозилметионина. Поэтому удивительно, как это ранее биохимические пути образования этого кофактора рассматривались вне связи с эпигенетической регуляцией. Только недавно выявлено, что мутация (hogl) гена арабидопсиса, кодирующего S-аденозил-Т-гомоцистеингидролазу, отвечает за определенные эпигенетические дефекты (Rocha et al., 2005).