2.5. Мейотический сайленсинг, осуществляемый неспаренной ДНК (MSUD)

MSUD, самое недавнее добавление к списку механизмов сайленсинга, действующих у Neurospora, был открыт Метценбергом и его сотрудниками (Агашауо and Metzenberg, 1996; Shiu et al., 2001; Shiu and Metzenberg, 2002) в ходе анализа любопытного наблюдения, заключавшегося в том, что мутация типа делеции в гене Asm-1 (созревание аскоспор) является функционально доминантной. Серия элегантных экспериментов, изображенная на рис. 6.14, привела к выводу, что последовательности, лишенные партнера по спариванию в мейотической профазе, вызывают мейотический сайленсинг идентичных или почти идентичных последовательностей. Наблюдение, что деления Awz-1 является доминантной (рис. 6.146), могло объясняться тем, что остающаяся единичная доза гена продуцирует неадекватный генный продукт, но эту возможность сделало маловероятной наблюдение, что функциональная копия этого гена в эктопическом положении не может комплементировать дефект (рис. 6.14в). Напротив, только одна функциональная копия этого гена требовалась в мейозе, если у функциональной аллели был партнер по спариванию, т.е. ее партнер мог нести мутации, делающие его неспособным производить функциональный продукт (рис. 6.14г). Нормальная мейотическая экспрессия этого гена наблюдалась у штамма, имеющего спаренные эктопические аллели и делеции нативного гена на обоих гомологах, что свидетельствовало о том, что сама по себе делеция не была «токсичной» и что эктопические копии действительно были функциональными (рис. 6.14д). Интересно, что некоторые аллели, индуцированные RIP, вызывают (elicit) MSUD, если эти штаммы способны к метилированию ДНК. но не могут вызвать MSUD в штаммах dim-2; это заставляет предполагать, что метилирование ДНК, нередко ассоциированное с такими аллелями, может подавлять спаривание (сравни рис. 6.14 г и 6.14 е) (Pratt et al., 2004). (Кстати говоря, это наблюдение дает нам также первое доказательство того, что DIM-2 является функциональным в половой фазе Neurospora.) Аллели с высокой плотностью мутаций, индуцированных RIP, оказались, подобно делециям, доминантными (рис. 6.14ж) (Shiu et al., 2001; Shiu and Metzenberg, 2002; Pratt et al., 2004), что согласуется с гипотезой о том, что они не способны спариваться с аллелью дикого типа Для того чтобы разграничить две возможности — что MSUD обусловлен отсутствием спаривания и что он обусловлен присутствием неспаренной аллели, — исследователи проанализировали скрещивание, в котором мейотическое ядро имело три копии гена: две аллели дикого типа (которые должны спариваться) и эктопическую копию (которая должна быть неспаренной). Наблюдался сайленсинг, что означало, что MSUD является результатом присутствия неспаренных аллелей, а не отсутствия спаренных аллелей (рис. 6.14з). MSUD можно наблюдать цитологически в скрещиваниях, гетерозиготных по гену, кодирующему белок, меченный [таггированный — tagged] GFP, как это показано на рис. 6.15.

Охота за мутантами, дефектными по MSUD, привела к идентификации эффективного [telling] члена машинерии MSUD. Ген Sad-1 (Supressor of ascus dominance — супрессор доминантности асков), идентифицированный путем отбора мутантов, способных проходить через скрещивание, в котором asm-1 не спарен, кодирует RdRP (Shiu et al., 2001). Это позволяло предполагать, что MSUD родствен «подавлению» (quelling) у Neurospora и, в целом, RNAi. Интересно, что геном Neurospora содержит гены, которые, согласно предсказанию, кодируют три предполагаемых RdRP (одна, необходимая для «подавления», одна — для MSUD и одна с неизвестной функцией), два белка, подобных Argonaute (один для «подавления» и один для MSUD) и два белка, подобных Dicer. Было бы замечательно, если бы удалось выяснить детальный механизм MSUD

^{Рис. 6.14. Мейотический сайленсинг. вызываемый неспаренной MHK(MSUD)}

^{Изображение тестов, проведенных в лабораториях Метценберга и Арамайо (Aramayo and Metzenberg, 1996; Shiuetal., 2001; Prattet al., 2004), описавших это явление Показаны только две из семи хромосомы Neurospora; их нуклеотидные последовательности изображены, соответственно, зеленым и синим цветом Прямоугольником показан ген, нормально функционирующий в мейозе. Вертикальными линиями показаны мутации, а метилирование ДНК показано красным цветом. Делеции изображены в виде пустых промежутков. Пояснения см. в тексте}