2.3 Исследования реликтов RIP позволило проникнуть в контроль метилирования ДНК

Неканоническое поддерживающее метилирование

Обнаружение того, что одна DMT, а именно DIM-2, ответственна за все выявляемое метилирование ДНК, было столь же удивительным, как и первоначальное обнаружение безудержного Irampant] метилирования в несимметричных сайтах у Neurospora, поскольку ни для одной ранее идентифицированной DMT не было известно, чтобы она метилировала цитозины в разнообразных по последовательности контекстах. Очевидный, но важный вопрос заключался в следующем: обязательно ли метилирование в несимметричных сайтах отражает потенциальную способность соответствующих последовательностей индуцировать метилирование de novo? Ранние опыты по трансформации не противоречили такой возможности; метилированные последовательности, лишенные их метилирования (например, с помощью клонирования), вновь обретали свое нормальное метилирование, будучи реинтродуцированы в вегетативные клетки. С сюрпризом столкнулись, однако, когда восемь аллелей гена ат, сгенерированных RIP, были протестированы на их способность индуцировать метилирование de novo (Singer et al., 1995). Некоторые продукты RIP с относительно немногочисленными мутациями (рис. 6.12, am^RIP3 и am^RIP4) не сделались реметилированными, даже в своем нормальном локусе; это позволяло предположить, что наблюдаемое метилирование представляло собой воспроизведение метилирования, установленного ранее. Важно отметить, что их метилирование, подобно другому метилированию, наблюдаемому у Neurospora, не было ограничено симметричными сайтами, не распространялось сколько-нибудь существенно с течением времени и было «гетерогенным» в том смысле, что паттерн метилированных остатков не был инвариантным в пределах клональной популяции клеток. Таким образом, это метилирование, хотя и зависимое от предшествовавшего метилирования, установленного в половой фазе (вероятно, с помощью RIP), могло не отражать действие «поддерживающей метилазы» того типа, который предполагался в оригинальной модели наследования паттернов метилирования. Заслуживает внимания, что MIP у Ascobolus, результатом которого также является гетерогенное метилирование, представляет первое доказательство воспроизведения метилирования ДНК у грибов (Rossignol and Faugeron, 1994). Способность Neurospora осуществлять поддерживающее метилирование была подтверждена экспериментально (Selker etal., 2002). Интересно, что воспроизведение метилирования оказалось сиквенс-специфичным (т.е. оно работает не на всех последовательностях), что добавляет новое измерение к концепции поддерживающего метилирования Хотя можно представить себе ряд возможных схем, результатом которых будет воспроизведение метилирования ДНК, действительный механизм, работающий у Neurospora, остается неизвестным. В принципе, поддержание метилирования в несимметричных сайтах могло бы зависеть от метилирования близлежащих симметричных сайтов, но наблюдаемое гетерогенное метилирование, включая сайты CpG, делает этот вариант маловероятным. Механизмы обратной связи с участием белков, ассоциированных с метилированной ДНК, могли бы приводить к метилированию, зависящему от предсуществующего метилирования, т.е. к поддерживающему метилированию. Как обсуждается ниже, данные, полученные на Neurospora (и других организмах), означают участие модификаций гистонов в контроле метилирования ДНК, указывая тем самым на возможную роль гистонов в поддерживающем метилировании

Участие гистонов в метилировании ДНК

Первым указанием на роль гистонов в метилировании ДНК было наблюдение, что обработка Neurospora ингибитором деацетилазы гистонов трихостатином А (TSA) снижала уровень метилирования в некоторых хромосомных районах (Selker, 1998). Селективность деметилирования под воздействием TSA могла бы отражать дифференциальный доступ к ацетилтрансферазам гистонов, но это не было достаточно тщательно исследовано (Selker et al., 2002). Благодаря исследованиям с мутантом dim-5 у Neurospora хроматин был однозначно связан с контролем метилирования ДНК. Этот мутант, подобно штаммам dim-2, обнаруживает полную утрату метилирования ДНК. SET-доменный белок DIM-5 оказался метилтрансферазой гистона H3, которая специфически триметилирует лизин 9 (Tamaru and Selker, 2001; Tamaru et al., 2003). Подтверждение того, что гистон H3 является физиологически релевантным субстратом DIM-5, дали два наблюдения: (1) замещение лизина 9 в H3 другими аминокислотами вызывает утрату метилирования ДНК и (2) триметил-лизин 9 обнаруживается специфически в метилированных участках хромосом.

Открытие того, что метилирование гистонов контролирует метилирование ДНК, по крайней мере у Neurospora, привело к постановке двух важных вопросов: (1) Что говорит белку DIM-5, какие нуклеосомы надо метилировать? (2) Что считывает триметильную метку и передает эту информацию к DMT, DIM-2? Факторы, контролирующие DIM-5, не были определенным образом идентифицированы, но имеются серьезные предположения, что он контролируется одним или несколькими белками, распознающими продукты RIP, и состоянием модификации аминокислотных остатков по соседству с местом его действия (Selker et al., 2002). Последнее должно давать возможность DIM-5 интегрировать информацию о том, должна ли быть метилирована ДНК в определенном участке, и дает возможное объяснение наблюдению, что TSA может ингибировать метилирование ДНК в некоторых районах.

Данные, полученные на других системах, привели к открытию того, что считывает триметильную метку на лизине 9 гистона H3 у. Знания о том, что НР1, белок, впервые идентифицированный у Drosophila (глава 5), связывается с метилированным лизином 9 гистона H3 in vitro, стимулировали поиски гомолога HPI у Neurospora. Вероятный гомолог был найден, и его участие в метилировании ДНК было протестировано методом дизрупции гена (Freitag et al., 2004а). Ген, названный hpo (НРопе), действительно оказался существенным для метилирования ДНК. Для еще одной проверки того, считывает ли НР1 у Neurospora метку, сгенерированную DIM-5, изучили его субклеточную локализацию у штаммов дикого типа и dim-5 У дикого типа HP1-GFP локализовался в гетерохроматиновых фокусах, но эта локализация была утрачена у dim-5; это подтверждало, что HPI Neurospora рекрутируется меткой (триметиллизин 9), сгенерированной DIM-5.

Данные о том. что РНК-интерференция (RNAi) играет важную роль в формировании и поддержании гетерохроматина у S. pombe, ставят вопрос о том, участвует ли машинерия RNAi у Neurospora в локализации НР1 и (или) метилировании ДНК. У Neurospora есть гомологи ряда генов, участвующих в RNAi (Borkovich et al., 2004).

Исследования мутантов с нуль-мутациями во всех трех генах РНК-зависимой PHК-полимеразы (RdRP), в обоих генах Dicer или в других генах, предположительно относящихся к RNAi, не обнаружили никаких свидетельств того, что RNAi участвует в метилировании H3K9. формировании гетерохроматина или метилировании ДНК у Neurospora (Chicas et al., 2004; Freitag et al., 2004c). Однако, как обсуждается ниже, гены RNAi у Neurospora принимают участие, по крайней мере, в двух других механизмах сайленсинга, имеющих эпигенетические аспекты: в «подавлении» (quelling) и в мейотическом сайленсинге.